黑木耳黑色素的研究综述

陈 雅，徐 苗，王欣宜，单欣荷，季琳凯，张拥军

（中国计量大学 生命科学学院，浙江 杭州 310018）

黑木耳（Auricularia auricula）隶属担子菌亚门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes）木耳目（Auriculariales）木耳科（Auriculariaceae）木耳属（Auricularia），为中国珍贵的药用和食用菌，早在19世纪，黑木耳就被用于民间医药，用于治疗咽喉痛、眼痛、黄疸等病症，并作为收敛剂[1-2]。黑木耳子实体是一种棕黑色的高碳水化合物含量（630 g/kg干燥子实体）的胶质菌[3]，是人类食用的第4种最重要的人工栽培蘑菇[4]，含多种人体不可缺少的营养成分[5]。

中国是黑木耳的主要生产国，年产量占世界总产量的90%以上，2017年中国黑木耳总产量已达638.84万吨，其市场潜力十分巨大。黑木耳黑色素安全性极高，且具有自由基清除能力、防紫外线、增强人体免疫功能等保健作用[6-8]，是极具发展潜力的天然功能性着色剂。

1 黑木耳黑色素的理化性质与结构表征

黑木耳子实体呈现黑褐色是因其富含的黑色素。黑色素是已知的生物色素中分布最广，含量最多的一类色素，由吲哚与酚类化合物氧化聚合而成[9，10]。黑色素分为真黑色素（含氮不含硫原子，黑色或棕色）、棕黑色素（含氮和硫原子，棕黑色、黄棕色或棕色）和异黑色素（黑色或棕色）3类[11，12]。真黑色素与棕黑色素的分子结构如图1所示，异黑色素由多酚氧化聚合而成，目前其具体的合成途径与结构尚不明确[13]。

图1 黑色素分子结构（左：真黑色素；右：棕黑色素）Figure 1 The molecular structure of melanin(left:eumelanin;right:pheomelanin)

黑色素的生物合成主要包括黑色素细胞迁移分裂、黑色素小体形成与黑色素合成、黑色素颗粒转运及黑色素排泄等过程[14，15]。合成过程主要涉及3种因素：底物酪氨酸、酪氨酸酶与参与催化的氧元素。

不同来源的黑木耳黑色素结构和理化性质相似，易溶于碱性溶液以及甲醇、丙酮、乙醇等有机溶剂，不溶于乙醚，溶解度随pH降低而减小，pH小于2.0时该色素基本上全部沉淀；具有一定耐热性和耐光性，对氧化剂和还原剂不稳定；金属离子Cu2+和Zn2+会使该色素产生沉淀，而Ca2+、Mg2+、K+和Na+对该色素的影响不明显[16]。其扫描电镜图像显示其为大块无定形物质，缺乏晶体结构[17]。

黑木耳黑色素具有均匀性，其组成与单体单元和聚合过程中的环境条件等因素有关。如何长川研究发现黑木耳黑色素中硫元素含量为0.54 g/100g，远远低于9 g/100g 的棕黑素中硫元素含量；氮元素含量为11.00 g/100g，略高于真黑素中氮元素的含量9 g/100g，基本符合真黑素中硫、氮元素的含量范围且与真黑色素结构特征基本相符[12]。李琦研究发现黑木耳黑色素N 元素含量为6.85%，含有S 原子和羧基、酚羟基、甲基、胺基、羰基等官能团，将其鉴定为棕黑色素[13]。侯若琳采用紫外-可见分光光度法（UV-Vis）、傅立叶变换红外光谱法（FT-IR）、元素分析、高效液相色谱法（HPLC）、核磁共振（NMR）分析手段，发现黑木耳黑色素平均分子量为48.99 kDa，分子中具有吲哚结构，符合真黑色素的典型特征[18]。Zou等从黑木耳子实体分离出黑色素I 与黑色素II 两种组分，分子量分别为384 kDa 与47 kDa，而黑色素粗提物主要成分是褐黑色素（pheomelanin），与黑色素I及II具有相同的溶解性和光谱性质，与黑色素II的L*、A*和B*值均高于黑色素I[19]。

近年来对发酵法获得的黑木耳黑色素的分子组成与结构的研究也有较大进展。如张晓娟发现发酵法获得的黑木耳黑色素含有酚羟基、羧基、氨基、羰基等官能团，初步推断其为真黑色素和棕黑色素的混合物，并以真黑色素为主[15]。邹宇等采用液体发酵、Sephadex G-100色谱分离获得两种黑木耳黑色素F1和F2，分子量分别为404.97 kDa和20.69 kDa，均含有C、N、O、H、S元素和酚羟基、胺基、羰基、乙烯基、次亚甲基、亚甲基及芳香族基团，属于棕黑色素[20]。Sun等通过紫外-可见分光光度法（UV-Vis）、高效液相色谱法（HPLC）、傅立叶变换红外光谱法（FT-IR）、核磁共振（NMR）和元素分析法，确定发酵法获得的黑木耳黑色素分子式的结构单元为[C18（OR）3H7O4N2]n，是一种真黑色素，也是5，6-二羟基吲哚和5，6-二羟基吲哚-2-羧酸的大分子聚合物[2]，其分子结构如图2。

图2 黑木耳黑色素的部分聚合物链结构Figure 2 Partial polymer chain structure of melanin from Auricularia auricula

综上，黑木耳黑色素溶于碱性溶液及极性溶剂，不溶于酸性溶液及弱极性与非极性溶剂，对光和热有较好的稳定性。通过菌种发酵获得的黑木耳黑色素为真黑色素与棕黑色素的混合物；而从黑木耳子实体中提取制备的黑色素主要为棕黑色素或真黑色素，这可能与黑木耳不同产地品种间的差异有关。

2 黑木耳中黑色素含量的影响因素

2.1 发酵液中的营养成分对黑木耳黑色素产量的影响

黑木耳菌株发酵生产时，发酵环境中盐对黑木耳菌株的生长与黑色素产量有一定影响。如宋丹靓敏等研究发现，浓度为0.5 g/L的Zn（CH3COO）2与CuSO4能抑制黑木耳菌丝生长；CaCl2可增加发酵过程中黑木耳的生物量；Zn（CH3COO）2与CaCl2可增加黑木耳菌株的黑色素产量[21]。另外，发酵液中的脂肪酸对黑木耳黑色素产量亦有影响。如武志超发现，黑木耳菌株发酵过程中，硬脂酸、油酸、亚油酸与棕榈酸的添加量在0.1%～1.0%时，对黑木耳黑色素的积累起促进作用，其中，硬脂酸添加量为1.0%时，黑色素产量达0.82±0.66 mg/mL，是对照组的1.49倍；油酸添加量为1.0%时，黑色素产量达0.87±0.71 mg/mL，是对照组的1.58倍[22]。

2.2 替代料及栽培条件对黑木耳黑色素产量的影响

么宏伟分别采用阔叶木屑、玉米秸秆、玉米芯等替代料，以及野生、棚栽、林下地栽与地栽等不同种栽培方式培养黑木耳，发现替代料基质可增加黑木耳中粗多糖、黑色素等功能性成分的含量，减少粗脂肪及锌、镁、铁等矿质元素的积累；栽培模式可显著影响黑木耳中常量营养和功能性成分，其中，添加阔叶木屑、玉米秸秆与玉米芯均可显著增加黑木耳黑色素的产量，降低胶状物质的积累[23]。

3 黑木耳黑色素的分离制备

3.1 黑木耳子实体黑色素的提取

黑色素的制备大多是利用其碱溶酸沉的性质，且酸沉过程中还可以利用酸的水解作用去除体系中的碳水化合物、蛋白质、脂质等杂质。黑木耳作为担子菌亚门真菌，其细胞壁结构不同于植物细胞壁，其细胞壁是排列在细胞质膜表面的多孔高分子复合物，含有抗应力的几丁质微纤维、线性葡萄糖聚合物或葡聚糖以及多种细胞壁蛋白，这种结构使得黑木耳细胞壁的壁层厚且质地异常坚韧，其破碎难度远大于植物。为增加黑木耳黑色素的溶出，大部分溶剂提取法还会辅助超声波技术或微波技术。超声波提取技术是利用超声波的空化效应、机械传质效应和热效应，提高细胞内容物的穿透力和传输能力，增大物质分子运动频率和速度，提高有效成分的浸出率。微波提取技术是利用微波的穿透性加热。另外，由于纤维素酶（多种水解酶组成的复合酶系）可有效破坏细胞壁，提高细胞壁内活性物质的提取效率，亦在食药用菌活性物质提取中得到广泛应用。黑木耳子实体中黑色素常见的提取方法见下表1[24-32]。常规的碱法提取（常用NaOH作为提取溶剂）或酸法提取（常用HCl作为提取溶剂）操作简便，但黑木耳黑色素的得率不高（在3%以下）。在常规提取基础上，辅助超声、微波等机械手段或机械手段与生物酶法协同处理，可使黑木耳黑色素的提取得率明显提高。如黑木耳子实体在NaOH碱提、高温高压、液氮研磨处理后，再采用超声波浸提的方式，黑木耳黑色素的提取得率可达到9.107%[25]。超声辅助NaOH 的提取方式，黑木耳黑色素的提取得率比传统溶剂法的提取率高26.94%[26]。微波辅助NaOH碱提，并加入95%乙醇（与NaOH体积比3∶13），黑木耳黑色素的提取得率可达到35.17%[28]。超声辅助Na2CO3的提取方式能使黑木耳黑色素的提取得率达到9.08%[30]。而通过纤维素酶对黑木耳子实体处理120 min后，再采用超声辅助NaOH的提取方式，可使黑木耳黑色素的提取得率达到10.48%[32]。

表1 黑木耳子实体中黑色素的提取方法Table 1 Extraction methods of melanin from Auricularia auricula fruit body

3.2 黑木耳黑色素的发酵法制备

针对黑木耳子实体生长周期长的特点，液体深层发酵法具有周期短、成本低、便于分离纯化等优势，近年来这方面的研究已引起关注，相关研究见表2[11，16，33-35]。采用发酵法制备黑木耳黑色素，发酵液的营养控制对于促进黑色素的产生非常重要。如Sun等研究发现，酵母提取物、酪氨酸和乳糖对黑木耳黑色素的产生有显著影响，在低碳和无碳培养基中黑木耳菌丝生长速率最高,而在低氮和无氮培养基中，黑木耳黑色素产量很低；酪氨酸能促进黑木耳黑色素的合成，培养基中酪氨酸缺乏导致黑木耳黑色素分泌减弱，无机盐对菌丝形态有显著影响，但对菌丝生长速率和黑木耳黑色素产量无明显影响[33]。由表2，通过优化发酵条件，黑木耳黑色素的产率在1 g/L以上，产率高的接近3 g/L，且发酵生产不受场地、气候限制，发酵条件易于控制，是一种很有前景的黑木耳黑色素生产方式。

表2 黑木耳黑色素的液体深层发酵法制备Table 2 Preparation of melanin from Auricularia auricula by submerged fermentation

综上，关于黑木耳黑色素的分离制备方面的研究已不断开展，每种方法各有其自身的特点，不同方法获得的黑木耳黑色素得率亦各不相同。由于从黑木耳中分离提取的黑色素还含有其它杂质从而影响其稳定性、生物活性及在食品领域中的应用，需进一步分离纯化。目前，大多采用化学方法（如热盐酸）或色谱法来纯化黑色素，以提高其高品质及进一步的分子结构研究。

4 黑木耳黑色素生物活性和功能特性

黑色素有许多重要的生物学功能，如黑色素得益于蛋白质的交联作用而能提供一些机械力并且保护蛋白质不被降解；黑色素形成过程中正醌的产生具有进化上的重要性，特别是那些亲核性的基团，如氨基（-NH2）和巯基（-SH），可使其获得抗生素特性；黑色素光吸收和光衍射的特性被利用在光受体的屏蔽上并被认为对爬行动物体温调节具有一定的作用等等[36]。

4.1 黑木耳黑色素清除自由基能力

自由基是一类高活性物质，含有未配对电子。自由基具有强氧化性，有极为活泼的反应性，能和各种细胞成分（膜磷脂、蛋白、核酸）发生反应，使膜的基本特性如变构、离子传递、酶活性等发生改变[37]。在机体稳态平衡失调的情况下，体内过量自由基的产生与许多疾病的发生、发展及有机体的衰老过程密切相关，是人体产生疾病的主要原因。由于自由基与人体疾病的发生、发展密切相关，因此摄入具有清除自由基能力的物质成为抵御自由基危害的重要途径。

天然黑色素的抗氧化能力主要表现为清除OH·、O2-·、DPPH·、ABTS+·、抑制脂质过氧化及具有还原力等方面[32]。黑色素清除自由基的机制一方面是其可在多聚物邻苯二酚和醌之间的电子离域产生大量半醌自由基，使其表现出显著的氧化还原性；另一方面是其具有很强的阳离子螯合特性，可通过羧基和羟基等阴离子起作用，阻止磷脂脂质体的氧化[25]。

黑木耳子实体与发酵法获得的黑色素均具有清除自由基能力。如张莲姬发现黑木耳子实体中黑色素可明显抑制小鼠正常肝匀浆的肝细胞脂质及蛋黄脂质的过氧化，其半抑制率浓度分别为0.065 mg/mL与0.110 mg/mL；黑木耳黑色素对OH·的半抑制率浓度为0.48 mg/L，对DPPH·的半抑制率浓度为0.176 mg/mL[38]。邹宇等通过发酵法制备的黑木耳黑色素F1和F2，浓度为1.0 mg/mL时均对O2-·清除率均超过80%，对OH·清除率均接近40%[39]。张敏等通过发酵法制备的黑木耳黑色素，当浓度为50 mg/mL 时，对ABTS+的清除率为97.69%，效果优于同浓度的Vc；当浓度为100 mg/mL时，对O2-·的清除率超过85%，效果优于同浓度的Vc[40]。上述研究表明，黑木耳子实体与发酵法制备的黑色素对O2-·、DPPH·、OH·、ABTS+、过氧化氢等均具有明显的清除效果，甚至优于同浓度的Vc及人工合成抗氧化剂BHT，同时动物体内实验亦表明黑木耳黑色素对小鼠脂质过氧化能力具有较好地抑制作用，作为功能色素具有极大的开发潜力与应用价值。

4.2 黑木耳黑色素抑菌抗病毒能力

黑木耳黑色素具有一定的抑菌抗病毒能力，如Li等通过实验证明纯化的黑木耳黑色素对细菌群体感应调控行为有显著抑制作用，且黑木耳黑色素在80 μg/mL时，对肠埃希氏菌K-12、铜绿假单胞菌PAO1和荧光假单胞菌P-3的生物膜形成抑制率分别是71.3%、61.7%和63.2%[41]。

4.3 黑木耳黑色素的抗辐射能力

黑色素作为目前所知唯一具有保护皮肤免受辐射伤害的天然聚合体，具有抗x射线、γ射线、宇宙射线、核辐射等多种辐射的作用，并能大量吸收可见与紫外光，保护机体细胞免受损伤。黑色素的抗辐射能力分为物理保护与化学保护：前者是通过吸收或散射等方式阻挡外来辐射；后者是通过黑色素清除光诱导产生的自由基，而使机体免受辐射伤害。Menter 等研究发现，黑色素在溶液中的电子转移和光保护特性证明黑色素作为紫外线吸收剂可有效避免紫外辐射对核酸、蛋白质等生物大分子的伤害[42]。

4.4 黑木耳黑色素改善肝损伤能力

肝脏作为人体重要的代谢和解毒器官，在糖类、脂肪、蛋白质代谢中起重要作用，其病变将会影响正常的新陈代谢。研究表明，大部分肝脏疾病如肝炎、肝硬化等的发生和发展都与氧化应激有关。刘城移等以四氯化碳致小鼠急性肝损伤为模型，通过血清酶指标、肝功指标的变化及病理切片，证明黑木耳黑色素能通过清除肝内过量自由基，增强肝内抗氧化酶活力，起到保护肝脏抗氧化系统的作用[43]。Hou等为探讨黑木耳中的天然黑色素对急性酒精性肝损伤小鼠的保肝作用，在乙醇致小鼠肝损伤前给予黑木耳黑色素，每日1次，连续3周，比较黑色素组和对照组小鼠肝功能生化指标、组织病理切片、抗氧化酶mRNA和蛋白表达。结果表明，黑木耳黑色素对乙醇性肝损伤具有保护作用，可显著降低小鼠肝脏指数、血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）和肝脏丙二醛（MDA）水平，增加肝脏乙醇脱氢酶（ADH）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）水平；其保护作用可能与核因子E2相关因子2（Nrf2）及其下游抗氧化酶如谷氨酸半胱氨酸连接酶催化（GCLC）、谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰剂（GCLM）和NADP（H）奎宁氧化还原酶1（NQO-1）的激活有关，提示黑木耳黑色素可能成为减轻酒精性肝损伤的有效策略[44]。

4.5 黑木耳黑色素保护DNA能力

活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）自由基是引起DNA氧化损伤的重要因素，黑色素对DNA的氧化损伤具有保护作用。Shcherba等研究发现，黑色素具有强抗氧化活性，极低浓度就可以防止过氧化物酶介导的氨基联苯降解产物对噬菌体-脱氧核糖核酸的破坏[45]。

5 结论

近些年，关于黑木耳黑色素的分离制备及其生物活性的研究已成为食品科学研究的热点。黑木耳是我国一种分布极为广泛且具有独特的营养价值与保健功能的食用菌，对于黑木耳相关性质的研究一直在进行，但在以下方面仍待深入与完善：（1）黑木耳黑色素提取的原料主要是黑木耳子实体，但黑木耳生产周期长，劳动强度大，产量和品质易受影响等问题，限制了黑木耳黑色素的研究以及应用。（2）黑木耳黑色素的提取难度高且得率低，严重制约黑木耳黑色素的研究和发展。要提高黑木耳黑色素的得率，必须综合使用化学方法、生物方法和现代仪器分析方法，不断探究黑木耳黑色素的绿色高效制备工艺。（3）黑木耳黑色素清除自由基作用机制方面的研究鲜有报道，其抗氧化应激的信号传导途径也未曾明确。（4）黑木耳黑色素分子结构尚不清楚，需进一步深入研究。故黑木耳黑色素的高效分离制备、分子结构及其清除自由基的作用机制研究仍有很大的拓展空间，其发展前景不容小觑。