一株猪关节源链球菌的分离鉴定及体外抑菌试验

区海蕴，周亚南，吴晨晓，梁润利，肖芬，万乐，万振鹏，张羿洋，朱芝秀

（江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045）

链球菌感染是导致现代养猪业重大损失原因之一[1]。据研究，链球菌可以随着血液循环到达各个器官引发炎症[2～6]，我国大部分猪场关节炎主要由猪链球菌等病原菌引起[7～8]。为了预防或治疗猪链球菌，部分猪场忽略饲养管理的因素而大量使用抗生素，导致链球菌耐药性日益加强[9～12]。2020年，南昌某猪场仔猪发生疑似链球菌感染病例，无菌采集病死仔猪关节积液，对其进行细菌分离鉴定和抑菌试验，找到治疗该病的有效方法，给临床治疗提供用药参考，减少抗生素的使用。

1 材料

1.1 病料

南昌某猪场死亡仔猪。

1.2 实验菌种

乳酸菌T-C-5、T-C-6、T-C-9：保存于江西农业大学预防兽医实验室。

1.3 器材及试剂

电子数显游标卡尺：上海美耐特旗舰店；牛津杯：上海申源科学仪器有限公司；TSA兔血琼脂平板，TSA血清肉汤，革兰氏染色液，瑞氏染色液：自行配制；测微尺：北京中西华大科技有限公司。

2 方法

2.1 细菌分离培养

无菌取仔猪关节液涂抹于TSA兔血琼脂培养基上，37℃温箱中培养48 h；挑选优势菌落再进行培养，最终获得ZF-1。

2.2 细菌的生化特性

将ZF-1分别接种添加血清的生化鉴定管，置于37℃温箱培养24～48 h，按照生化鉴定试验说明书滴加相应的指示剂，观察并记录结果。

2.3 分离菌的分子生物学检测

采用细菌16SrRNA通用引物，按照细菌常规扩增法[13]，将ZF-1进行PCR扩增，PCR扩增产物交由湖南擎科生物科技有限公司测序，并进行核苷酸序列同源性比对（在NCBI内）和进化树构建（利用MEGA7.0系统）。

2.4 体外抑菌试验

2.4.1 药敏试验。在TSA血清肉汤中接种分离菌ZF-1培养24h（37℃、200r/min摇床震荡），培养液涂布于TSA兔血琼脂培养基，其上均匀放置药敏纸片7片，在37℃温箱中静置培养24h后测量抑菌圈大小。

2.4.2 乳酸菌体外抑制试验。在TSA血清肉汤中接种分离菌ZF-1培养24h（37℃、200r/min摇床震荡），培养液涂抹5%血清琼脂平板，其上均匀放置3个牛津杯（静置2min），牛津杯内分别滴加乳酸菌T-C-5、T-C-6、T-C-9发酵液，每个牛津杯0.3mL，移入冰箱过夜，待菌液充分扩散，放入37℃温箱静置培养24h后测量抑菌圈大小。

3 结果与分析

3.1 分离菌的培养特性

培养48h后，TSA兔血琼脂平板有菌落生长，单菌落圆形，边沿整齐，表面光滑，湿润，呈α溶血（图1）；显微镜观察菌体成对或呈短链状，有荚膜，为G+短杆菌（图2）。

图2 革兰氏染色镜检结果

3.2 分离菌的生理生化特性

结果见表1，ZF-1不能发酵甘露醇和乳糖，能分解尿素，能产明胶酶，能还原硝酸盐，不能利用枸橼酸盐。

表1 分离菌生理生化特性

3.3 分离菌的分子生物学检测

电泳结果如图3所示，目的条带在约1 500bp处出现。使用Megalign进行同源性分析，可见ZF-1与链球菌同源性最高（图4）。使用MEGA 7.0软件进行系统进化树分析，发现ZF-1与MT585635.1和KR819497.1亲缘关系最近（图5）。

图3 分离菌PCR扩增结果

图4 分离菌基因序列同源性分析结果

图5 分离菌基因序列系统进化树分析结果

3.4 体外抑菌试验

3.4.1 药敏试验。结果见表2，ZF-1对部分青霉素类、头孢类、酰胺醇类等抗生素敏感，对部分大环内酯类、磺胺类、喹诺酮类、林可胺类等抗生素完全耐药。

表2 药敏试验结果 mm

3.4.2 乳酸菌体外抑菌试验。结果见表3，乳酸菌对ZF-1有显著的抑制作用，其中T-C-5抑菌效果最好。

表3 乳酸菌抑菌试验结果 （mm）

4 讨论

根据分离菌的培养形态、生化特性,对比《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)[11],初步确定分离菌为链球菌，用分子生物学方法进行进一步鉴定，确定ZF-1为链球菌。ZF-1形态与表面特征与史丽华[8]、姚火春[12]、张奥[14]报道的一致，与Moor的β溶血不一致，可能是菌株的差异。ZF-1显微镜下观察结果与史丽华[8]、陈楠楠[15]报道的一致。

ZF-1药敏试验中，对链霉素、麦迪霉素、多黏菌素B、甲氧氨苄嘧啶、诺氟沙星、克林霉素完全耐药性，与卿任科[2]、刘瑞雪[16]的结果一致，与黄千年[17]有差异，由此可见链球菌耐药性问题十分严重，急需寻找替代物。近年来乳酸菌的研究成为了热点,如刘小兰[18]等报道：肠乳杆菌可代替抗生素的使用，减少耐药性的发生，与乳酸菌T-C-5对链球菌的抑制作用不谋而合。

人和动物容易被链球菌感染，并能引起多种人畜共患病[7]，我国出现过两次较大规模猪链球菌感染人事件[9]，猪链球菌感染人的卫生事件已经引起全世界的关注，切断猪链球菌这个传染源显得尤为重要。

猪链球菌主要是由于猪之间的紧密接触，由鼻子通过呼吸道的途径传播，健康带菌猪更易于通过密切接触将感染传播给其他猪[9]。通风不良，密度过大，粉尘多等饲养管理条件不当和仔猪的运输应激导致的免疫力下降等更加容易发生链球菌的感染。

防治猪链球菌最优的方法是：一是防患于未然，尽量自繁自养，减少外界病原菌的侵入。二是改善猪舍环境，加强饲养管理，尽量减少链球菌感染，预防比治疗更重要。三是若已经发生链球菌的感染，可对病原菌进行药敏试验选择两三种抗生素混合使用加强药效。四是可研究新的方法替代抗生素的使用减少耐药性的发生。