猪增生性肠炎的诊断及其在猪群中感染的调查

肖童，魏黄思梧，刘昌锦，林敏，刘小兰，胡换仪，邓舜洲

（江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045）

猪增生性肠炎(porcine proliferative enteropathy,PPE)是由胞内劳森菌(Lawsonia Intracellularis，LI)感染引起的一种以回肠和结肠隐窝内未成熟的肠细胞发生腺瘤样增生为特征的猪肠道传染病。该病能够引起保育猪和育肥猪不用程度的出血性或间歇性腹泻、消瘦、生长缓慢等症状。胞内劳森菌属于脱硫弧菌科劳森菌属的革兰氏阴性菌，早在1931年就有报道，曾被称为弯曲菌样微生物（CLO）[1]，患病猪日增重减少，饲料转化率低，严重可导致死亡，对世界范围内的养猪业造成了巨大的经济损失[2]。胞内劳森菌在临床上主要表现为猪肠腺瘤病(PIA)和猪增生性肠病(PPE)，其严重程度、临床症状与受感染动物的年龄相关[3]。2020年7月份江西省某猪场出现疑似胞内劳森菌的病例，对其进行临床解剖和实验室诊断，确诊为胞内劳森菌感染。并对该区域的其他7个猪场进行荧光定量PCR检测，查看该区域猪群的感染情况。

1 临床症状

2020年7月份江西省某猪场肥猪采食正常，但生长缓慢、体型瘦小，部分猪出现排黑色柏油状稀粪便症状（图1），体表苍白，未出现死亡病猪。

图1 血便

图2 回肠黏膜增厚

2 病理解剖

对病猪解剖发现回肠黏膜增厚，出现隆起（图2），并呈现特征性分支状皱褶，表面湿润而无粘液。

3 实验室诊断

3.1 PCR检测

按照Ezup动物基因组DNA提取试剂盒方法提取DNA,用普通PCR方法进行检测。1%琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，扩增出了581 bp左右的单一条带。将测序结果在NCBI上通过BLAST在线工具进行比对，通过DNA STAR软件对比对结果序列进行分析，结果显示测序菌株（CEXU）与胞内劳森菌参考序列（AM180252.1和CP004029.1）同源性为100%，且处于进化树同一分支（图4）。

图3 PCR检测结果

图4 序列系统进化树分析结果

3.2 荧光定量PCR检测

使用赛默飞VetMAXTML.intracellularis Kit对提取的核酸进行荧光定量PCR检测。结果显示，样品胞内劳森菌阳性。

4 诊断

通过临床诊断及病理解剖，初步诊断为胞内劳森菌感染。经过普通PCR检测，结果显示样品DNA和胞内劳森菌疫苗均出现581 bp左右大小的目的条带，而阴性对照没有条带；序列分析其与胞内劳森菌参考序列（AM180252.1和CP004029.1）同源性为100%；又经荧光定量PCR检测为阳性。因此，上述病例可确诊为胞内劳森菌感染。

5 猪胞内劳森菌在猪群中的感染调查结果

通过对7个猪场的326份粪便样品进行荧光定量PCR检测，结果如表1所示：不同猪场的阳性检出率区间为16.67%～40.00%，其中225头母猪阳性检出率为29.33%，82头保育猪阳性检出率为35.37%，17头育肥猪阳性检出率为17.65%，2头种公猪阳性检出率为0%，平均阳性检出率为30.06%。

表1 猪胞内劳森菌在猪群中的感染调查结果份、%

6 讨论

由于该病的病原胞内劳森菌属专性胞内细菌，其分离和培养方法都不完善，并且该病经常呈亚临床症状，养殖者对其的重视程度不高，这在很大程度上影响了对猪增生性肠炎的诊断与防治。本研究通过对患病猪进行临床诊断和实验室检测，确诊为胞内劳森菌感染。后续对该地区7个猪场进行随机采样，通过荧光定量PCR检测，发现阳性率达30.06%,表明胞内劳森菌在该地区存在流行性。

普通PCR在应用于明显患病动物的组织样品或粪便时具有良好的灵敏度，但检测亚临床症状的猪粪便往往会出现阴性结果[4]，本实验使用赛默飞荧光定量检测试剂进行荧光定量PCR检测，准确性和阳性检出率更高。彭忠等建立一种套氏PCR方法检测粪便中的胞内劳森菌[5]，对1 000多份粪便样品进行检测，其结果表明该方法相较于普通PCR方法有较高的灵敏度和良好的特异性。刘立兵等建立胞内劳森菌实时荧光RPA方法[6]，能够有效快速的应用于猪增生性肠炎的检测，因此一种灵敏度高的检测方法对于未来养殖业的发展是必要的。

随着一些欧洲国家对抗菌药物的限制使用，增生性肠炎已经成为影响养猪业发展的重要疾病之一[7]。中国作为养猪大国，虽然抗菌药物对猪增生性肠炎的治疗有作用，但抗菌药物的频繁使用会导致劳森菌产生耐药性，因此提前完善养猪行业的管理措施和消毒措施、对养殖人员进行知识培训、推动疫苗和营养添加剂的使用能够有效地减少劳森菌对养猪行业的影响[8]。市场上使用的猪增生性肠炎菌苗有Intervet(荷兰英特威)公司肌肉注射灭活苗和Oehringer Ingelheim(德国勃林格殷格翰)公司口服无毒活苗，能有效阻止其在宿主体内引起病变，对于胞内劳森菌的增殖有一定的抑制作用[9]。WHITNEY等研究表明饲料中添加含有可溶物和大豆皮的酒糟干[10]，能够轻微的减轻胞内劳森菌的感染。LEITE等研究表明饲料中锌氨基酸复合物的添加也可以显著减少由劳森菌引起的感染和损伤程度[11]。

胞内劳森菌作为一种严重影响养殖效益的胞内寄生菌，建立一套高效可行的检测方法是非常必要的，本实验通过对胞内劳森菌进行荧光定量PCR检测，准确性高、检测效率高，比常规检测方法更具有优势，为今后该病的检测诊断提供理论基础。