FLT3基因在成人急性淋巴细胞白血病中突变的特征及临床意义

张雪楠，李威，郭荣群，李文文，徐婷婷，姜中兴

(郑州大学第一附属医院 血液科，河南 郑州 450052)

FMS样酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinases 3，FLT3)为Ⅲ型受体酪氨酸激酶家族(rrceptor tyrosine kinases，PTK)成员之一，在骨髓中仅表达于造血干/祖细胞中，FLT3与其配体(FLT3 ligand，FL)在正常造血细胞的增殖、分化和存活中发挥重要作用[1]。FLT3由5个免疫球蛋白样胞外域、1个跨膜域、1个膜旁结构域(juxtamembrane，JM)和2个由激酶插入结构域连接的细胞内酪氨酸激酶结构域(tyrosine kinase domain，TKD)组成[2]，是血液系统恶性肿瘤中常见的突变基因之一，JM的内串联重复(internal tandem duplication，ITD)和TKD的激活环中天冬氨酸835点突变是其最常见的两种突变类型[3]。急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一种发生在B细胞或T细胞系的具有独特遗传学特征的克隆性造血系统疾病[4]。FLT3突变在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)中很常见(约占30%)[5-6]，而在ALL中较少见且预后及意义不明，常发生在MLL基因重排ALL和高超二倍体(>50条染色体)ALL中[7-8]。本研究对250例成人ALL患者进行二代测序(next generation sequencing，NGS)，探讨FLT3基因突变特征及其临床意义。

1 材料和方法

1.1 病例资料选取2017年1月至2020年3月在郑州大学第一附属医院血液科就诊的初治成人ALL患者250例。所有患者均按照MICM(细胞形态学、免疫学、细胞遗传学、分子生物学)确诊和分型(WHO 2016诊断标准[9])。250例患者中，急性B淋巴细胞白血病(acute B cell lymphoblastic leukemia，B-ALL)205例，急性T淋巴细胞白血病(acute T cell lymphoblastic leukemia，T-ALL)45例，男性137例，女性113例，年龄14～82岁，中位年龄30岁，初诊外周血白细胞计数(0.10～465)×109L-1，中位白细胞计数15.8×109L-1。本研究骨髓标本采集患者均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器本研究所用血液基因组DNA提取试剂盒(0.1～1 mL)为中国Tiangen公司产品，配套试剂为上海源奇生物医药科技有限公司生产的ALL相关基因突变检测试剂盒(22)及美国Illumina公司生产的Miseq v2-25m(reads)试剂盒。白血病免疫分型采用美国Becton Dickinson公司生产的FACSC anto流式细胞仪及配套单克隆抗体。突变基因检测采用美国Bio-Rad公司生产的普通PCR、德国Eppenddorf公司生产的低温离心机及美国Illumina公司生产的Miseq二代测序仪。

1.3 标本采集与基因检测采集患者初诊时骨髓液标本2～4 mL，肝素管抗凝，收集骨髓单个核细胞后进行DNA提取，具体制备方法参见文献[10-11]。FLT3基因的14、15和第20外显子(exon)扩增引物序列参见文献[11-12]，余包括NOTCH1、IL-7R、TP53、JAK3、CREBBP、FBXW7、PAX5、IKZF1、JAK1、PHF6、SH2B3、JAK2、CRLF2、PTEN、NT5C2在内的共16种突变基因的二代测序操作流程参见文献[12]。流式细胞免疫表型分析方法参见文献[13]。

1.4 疗效评定及指标分析250例患者中，20例未在郑州大学第一附属医院治疗，余患者根据情况接受VDC(L)P[长春新碱类+蒽环类+环磷酰胺+(门冬酰胺酶)+糖皮质激素]方案诱导治疗，BCR-ABL阳性患者加用伊马替尼、达沙替尼等酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)。依据《血液病诊断及疗效标准》[14]评定疗效。所有病例随访至2020年6月30日，采用查阅住院病例及电话联系的方式，失访患者17例，失访率6.80%(17/250)。总生存期(overall survival，OS)指从确诊至死亡或末次随访日期的时间。无进展生存期(progression-free survival，PFS)指从治疗后第1次完全缓解(complete remission，CR)至第1次复发或缓解期死亡或末次随访日期的时间。收集并分析患者的临床指标，包括患者性别、年龄、实验室检查[白细胞计数(white blood cell，WBC)、血红蛋白(hemoglobin，Hb)、血小板计数(platelet，PLT)、淋巴细胞绝对值(lymphocyte count，LYM)、外周血细胞形态、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)、骨髓细胞形态学、流式细胞学、染色体、融合基因、突变基因、FLT3突变类型及突变位点等]、影像学检查、确诊时间及转归。

1.5 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件进行数据处理，计量资料以中位数(四分位数)即M(P25，P75)表示，两组间比较采用Mann-WhitneyU-test(非参数检验)；计数资料以频数和率(%)表示，两组间比较采用χ2检验或Fisher确切概率检验，生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线，并用log-rank检验进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1FLT3基因在成人ALL中的突变特征250例初发成人ALL患者中，共观察到FLT3突变11例(详见表1)，突变率为4.40%(11/250)，突变总频次12次(1例双突变)，分别包括2个ITD突变、5个TKD突变(2个D835和Y842C、D839G、836_837del共3个非D835)、2个膜旁插入缺失突变(juxtamembrane indel mutation，JM-InDel)(Y597delinsPY、598_600del)和3个膜旁点突变(juxtamembrane point mutation，JM-PM)(Y589H、F594I、V592A)。6例发生在外显子14，5例发生在外显子20。其中男性5例(45.45%)，女性6例(54.55%)。8例突变发生在B-ALL(3.90%，8/205)，3例突变发生在T-ALL(6.67%，3/45)，B-ALL与T-ALL两组FLT3突变率比较，差异无统计学意义(χ2=0.174，P=0.676)。

表1 FLT3基因突变患者临床特征

2.2FLT3基因突变与临床、实验室指标的相关性FLT3突变组与无突变组患者年龄、性别、WBC、Hb、PLT、LYM、LDH、骨髓及外周血原始细胞比率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 两组临床指标对比[M(P25，P75)]

2.3FLT3基因突变与预后生存的相关性患者OS时间0.1～40个月，中位OS时间18.40个月，PFS时间0.1～40个月，中位PFS时间9.90个月。FLT3突变组中位OS时间18.50个月，无突变组中位OS时间17.30个月，两组OS比较，差异无统计学意义(χ2=0.006，P=0.941)(图1)；FLT3突变组中位PFS时间10.00个月，无突变组中位PFS时间9.90个月，两组PFS比较，差异也无统计学意义(χ2=0.305，P=0.581)(图2)，考虑可能与FLT3突变患者病例数较少有关。

图1 两组总生存分析比较

图2 两组无进展生存分析比较

3 讨论

ALL是在骨髓、外周血以及其他器官以未成熟淋巴细胞恶性增殖为特征的高度异质性肿瘤，其生物学特征和临床表现具有高度异质性，成人ALL与儿童ALL，T-ALL与B-ALL之间都具有不同的临床及实验室特点[4]。虽然儿童ALL的长期无病生存率超过了80%，但目前成人ALL仍然面临复发、难治、预后差的风险。随着对ALL发病机制的深入研究及NGS等新技术的应用，不同分子生物学及细胞遗传学特征在ALL明确预后、危险分层、指导治疗方面的重要作用日益突出[15]。

目前关于FLT3突变的研究多集中于突变率较高的AML，而ALL伴FLT3突变率较低，报道较少，主要集中于婴幼儿。Kabir等[8]报道儿童ALL中FLT3突变率为6.3%，且多见于MLL基因重排和高超二倍体(分别为15.7%和14.4%)，预后不明。Alkhayat等[16]报道FLT3在儿童ALL患者总体突变率为4.7%(3/64)，与预后无关。FLT3在成人ALL中的相关研究数据甚少。Zhen等[17]报道117例成人ALL中8例存在FLT3突变，突变率为6.8%，(B-ALL 4/96例，4.2%；T-ALL 4/21例，19.0%)。本研究中FLT3在成人ALL患者中的总突变率为4.40%(11/250)，位于外显子14和外显子20，其中B-ALL的FLT3突变率为3.90%(8/205)，T-ALL的FLT3突变率为6.67%(3/45)，突变多见于T-ALL，与既往报道一致。

本研究观察到B-ALL中FLT3突变患者有2例合并存在CREBBP突变。CREBBP(或CBP，编码CREB结合蛋白)及其类似物EP300(P300)是转录共激活因子，调控多个参与癌症发病的基因，在染色质重塑中起重要作用，可能与淋巴系统恶性肿瘤的预后有关[18]。既往无CREBBP与FLT3共突变相互作用的文献报道。此外，本研究还观察到FLT3与PAX5突变共存的现象，PAX5是B细胞分化和发育中起重要作用的转录因子[19]，既往未见与FLT3共突变的报道。本研究中3例共突变患者均持续缓解，预后较好，FLT3与CREBBP/PAX5突变是否具有相互作用及其对预后的影响有待扩大样本量进行更深入的突变功能机制研究。本研究未发现FLT3突变与NOTCH1、IL-7R、JAK3、TP53、FBXW7、CRLF2等基因突变合并存在。

研究报道，FLT3突变大多是激活突变，ITDS可能干扰JM结构域的抑制性结构域并促进二聚化。D835突变被认为是改变构型，暴露酪氨酸激酶的活性位点，并允许增加ATP和底物的进入，以增加固有的酪氨酸激酶活性水平，导致结构性酪氨酸激酶激活[20]。关于JM-InDel的报道较少，Chatain等[21]在7例AML患者中发现FLT3膜旁区(n=6)和跨膜区(n=1)的缺失或缺失插入，进而导致FLT3蛋白的框内缺失(n=4)和截短突变(n=3)，通过促进抑制域和激酶结构域的分离，FLT3的自抑制构象被破坏，导致FLT3下游信号通路的结构性激活，并且对FLT3激酶抑制剂的敏感性高于ITD，具体机制还需要进一步探讨。本研究中Y597delinsPY、598_600del突变既往未见报道。FLT3-JM-PM位于氨基酸V572和D600之间，本研究中Y589H、F594I、V592A在AML中均已被证实是激活突变，可导致FLT3下游信号通路的组成性激活，并对FLT3激酶抑制剂敏感[20]。本研究中例9初始高白细胞的T-ALL患者，化疗半疗程未缓解，加用索拉菲尼后目前持续缓解，表明FLT3抑制剂可能对FLT3突变的难治ALL患者有利，但由于例数较少，需进一步扩大样本量进行临床研究并长期随访观察预后。

FLT3突变在AML患者中约占30%，其中FLT3-ITD突变与预后不良显著相关，而FLT3-TKD点突变与AML预后的相关性仍不明确。与AML不同，ALL中FLT3突变占1%～3%，且TKD比ITD突变更常见[5-8]。由于突变率低，既往研究几乎均显示FLT3突变对ALL患者预后无显著影响。本研究显示，11例患者除1例半疗程缓解后死亡外，余10例患者1个疗程均CR，没有发现与BCR-ABL融合基因、中枢神经系统侵犯有关，这和FLT3突变的AML患者治疗难度大且预后不良这一临床特征有所不同。通过分析未发现FLT3突变与ALL患者的临床预后显著相关，但倾向于改善OS和PFS，原因可能是由于FLT3突变病例少，治疗方案不同以及随访时间不足等。需要扩大样本量来最终阐明ALL中FLT3突变的临床相关性。

综上所述，本研究表明FLT3突变在初发成人ALL患者中不常见，观察到的部分突变位点及共突变基因类型在成人ALL中未见报道，其功能和机制有待深入探讨。FLT3突变与预后无明确相关性，FLT3抑制剂可能对FLT3突变的难治ALL患者有利，需要更大样本量的前瞻性临床研究进一步明确FLT3突变在成人ALL中的预后意义。