生物治疗通过Hedgehog通路抑制非小细胞肺癌研究进展

宣成睿,苏秀兰,苏依拉其木格

(1. 内蒙古医科大学基础医学院病理生理教研室, 内蒙古 呼和浩特 010059;2. 内蒙古医科大学附属医院临床医学研究中心)

肺癌已成为全球成年人最常见的恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率分别为11.6 %、18.4 %[1]。在我国，肺癌的5年生存率仅仅为17.7 %[2]。肺癌可分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(NSCLC)两类，其中NSCLC占85 %。近年来，随着分子靶向治疗、免疫抑制剂和抗血管生成剂的使用，对肺癌的治疗效果显著，但疾病复发、转移、耐药等仍是亟待解决的问题，这些涉及了Hedgehog(Hh)、Wnt、EGFR/PI3K/AKT等多个信号通路的调控过程。其中Hh通路作为靶向治疗中关键的信号通路， 其异常激活促进了肺癌的发生。研究表明，阻断Hh通路可能成为靶向药物治疗的关键。本文就Hh通路及其关键靶基因及生物制剂治疗NSCLC的研究进展进行概述，从而为靶向治疗非小细胞肺癌提供可能的依据。

1 Hh 信号通路的生物学概况

Hh通路从果蝇到人类都高度保守，是胚胎发育的关键调节因子，参与中枢神经管、消化管和支气管发育的调节作用，也可参与骨、软骨、肺等多种器官的发育过程[3]。在哺乳动物中，Hh通路包括三种配体: Indian Hedgehog (Ihh)、Desert hedgehog (Dhh)和 Sonic hedgehog (Shh)，其中SHh是最有效的配体，在成人组织中分布最广泛[4]。Hh通路的受体包括分布于靶细胞膜上的Patched (Ptch) 受体、Smoothened (Smo) 受体，转录因子(Gli)蛋白家族，主要校正器 (Sufu) 蛋白及下游的驱动蛋白 (Kif7)、蛋白激酶A (PKA)等，其中Smo受体是Hh信号通路中的重要调控因子[3]。

1.1Patch受体 Ptch受体是12跨膜蛋白，属于肿瘤抑制蛋白。哺乳动物中包含两种，Ptch1和Ptch2，Ptch2 蛋白是 Ptch1 蛋白的旁系同源，可以弥补 Ptch1蛋白的部分功能。Ptch1由1 447个氨基酸组成，包含两个相互作用的细胞外结构域ECD1和ECD2，其可以与Hh信号蛋白结合；有十二个跨膜片段(TMs)，其中TMs 2-6构成了固醇感应域(SSD)，可以结合胆固醇，抑制Smo蛋白的功能[9]。目前针对抑制Smo蛋白的机制，研究者发现， Ptch1可作为胆固醇转运体，当Shh结合到Ptch上后，通过转运细胞膜中的胆固醇，使胆固醇结合到Smo受体N端的CRD结构域，使Hh通路激活[9]。

1.2Smo受体 Smo受体属于G蛋白偶联受体家族的一员，由1 024个氨基酸组成，结构上的7次跨膜(7TM)α螺旋结构与A类GPCR蛋白相类似[5]。Smo的结构包括含有N末端富含半胱氨酸结构域的胞外结构域(CRD)，一个铰链结构域(HD)、一个七次跨膜α螺旋(TM1-TM7)结构域(TMD)和一个胞内C末端结构域[6]。从结构上看，CRD位于TMD的正上方，一侧为胞外环3(ECL3)，另一侧由连接环构成，CRD和TMD通过HD连接[7-8]。Smo受体是Hh通路中重要的转换器，在信号转导过程中起着中心调控作用。

图1A Smo结构示意图(参考文献[8])

1.3Smo 受体下游因子 Hh通路的Smo膜蛋白下游因子包括Gli、SuFu、Kif7、PKA 和 TULP3 等。

1.3.1Gli转录因子 Kinzler KW等人从胶质母细胞瘤中分离出来Gli蛋白，包括Gli1、Gli 2和Gli3[10]，Gli包含5个保守的锌指DNA结合序列，以序列特异性方式与DNA结合。Ruiz i Altaba团队提出的”Gli code”模型中，Gli1仅仅作为一个转录激活因子，Gli3是主要的抑制因子。Tolosa发现Gli1/Gli2可以形成复合物，并揭示了Gli1也具有转录抑制因子的能力，而且证明了Gli1和Gli2的功能可以相互替换，但在维持癌细胞表型和维持干细胞状态方面，Gli1发挥重要的作用，Gli2还不能完全取代[11-12]。这一新的论点为研发Gli抑制剂提供了新的线索，有利于新药的研发。

1.3.2SuFu、PKA和Kif7等下游因子 Sufu在Hh通路中起负性调控作用，可直接与Gli蛋白结合，同时磷酸酶A( PKA)和糖原合酶激酶3β(GSK3β)作用于Sufu的Ser-346和Ser-342处，使Sufu磷酸化，抑制Sufu - Gli解离[13]。蛋白磷酸酶4调节亚基2(Ppp4r2)与Sufu蛋白相互作用，促使Sufu蛋白去磷酸化，促进Sufu - Gli解离[14]。驱动蛋白Kif7既能促进也能抑制Hh信号传导，脂蛋白A1(PPFIA1)和蛋白磷酸酶PP2A共同作用，可促进Kif7去磷酸化，使Kif7定位到纤毛的末端，促进Gli的转录[15]。Hh 通路的下游，还有很多参与调控Hh信号传导的基因，在诱导细胞增殖及肿瘤发生等方面发挥着重要的作用。

2 Hh通路的激活

Hh通路在成年人体内参与伤口的愈合和组织修复，一般情况下处于休眠状态。Eduardo D等[16]研究发现 Shh 信号转导依赖于纤毛核心中的运输。在 Gigante ED 等[17]研究证实，Hh通路与初级纤毛密切相关，初级纤毛不仅为通路组件的分布提供了至关重要的空间，而且还能参与通路各元件的调节作用，从多方面保证了 Hh 通路发挥功能。

在不存在SHh配体的情况下，纤毛膜中可以检测到Ptch1蛋白，Ptch1结合胆固醇，使Smo的结构域CRD空置，Smo处于抑制状态。Sufu-Gli复合物的形成也是通路中重要的抑制因素，并且蛋白激酶A(PKA)、酪蛋白激酶I(CKI)、糖原合酶激酶3β(GSK3β)具有稳定Sufu蛋白的作用，以上复合物通过驱动蛋白家族7(KIF7)构成复合物支架，将其运送到纤毛远端，Gli不能从复合物中解离，从而抑制GLI1/2进入细胞核[18]。再有Tubby家族蛋白3(TULP3)还负责将G蛋白偶联受体GPR161募集到纤毛中，负调节剂GPR161激活腺苷酸环化酶3(AC3)，促进PKA激活，从而直接促进Sufu-Gli复合物的形成，使Hh通路处于抑制状态[19]。

当存在Shh配体时，它会结合到Ptch1受体上，使胆固醇从Ptch1上解离，连接到Smo 蛋白，激活Smo蛋白[9]。一方面Smo解除Sufu对Gli1/2的抑制作用，并发现蛋白磷酸酶4调节亚基2(Ppp4r2)可以结合到Sufu蛋白上，导致Sufu蛋白降解[14]；另一方面Smo蛋白抑制TULP3的活性，并促进了Gli2-Sufu复合物的解离，使Gli2磷酸化为其激活剂形式(GLIA)，然后将其从纤毛中穿梭出来，进入细胞核中。影响Hh基因的转录过程[16]。

3 非小细胞肺癌研究中与Hh通路有关的潜在的生物标记物

肺癌出现的耐药现象与Hh通路激活有关。激活Hh通路的因素具有复杂多样化，因此探索NSCLC相关的治疗靶点至关重要，并研发药物的任务仍需进行。表皮生长因子受体(EGFR，也称为ERBB1)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、ROS1原癌基因受体酪氨酸激酶(ROS1)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶b - raf(BRAF)的激活性基因突变或融合现在已成为NSCLC中激酶抑制剂治疗的靶标，并且目前正在评估其他靶向性NSCLC3致癌驱动子亚型的靶向治疗[20-21]。尽管靶向治疗可以改善NSCLC患者的预后，但对这些药物的反应通常是不完全的和暂时的，靶向治疗容易产生耐药复发现象，故预测并探索相关生物标记物将有助于患者的个体化治疗方案的实施。

在众多的预测靶向治疗的靶点中，一些靶点与非小细胞肺癌密切相关，经过大量的实验验证后，可能成为非小细胞肺癌个体化靶向治疗的靶点。Jia Pan等人发现造血前B细胞白血病转录因子(PBX)相互作用蛋白(HPIP)在NSCLC组织和细胞株中表达更高，敲低NSCLC细胞中HPIP，可显著抑制A549细胞中Shh、Smo、Ptc和Gli-1蛋白的表达，并抑制A549的增殖、迁移和侵袭能力[22]。E3泛素连接酶HERC4在NSCLC中呈低表达，与Smo负相关，具体机制是通过破坏Smo的稳定性而发挥抑制肿瘤作用，当敲除HERC4基因则会激活Hh通路，进而促进NSCLC细胞的增殖[23]。再有实验证明磷脂酰乙醇胺结合蛋白4(PEBP4)在人肺癌组织、A549、H1299和H460非小细胞肺癌细胞系中均高表达，PEBP4过表达显著促进了非小细胞肺癌细胞中Shh信号的转录活性，使用环丙胺抑制Shh信号可以显著改善PEBP4过表达，抑制NSCLC细胞的增殖、侵袭和迁移[24]。以上几种因子都可激活Hh通路。肝激酶B1(LKB1)可以有效的抑制Hh通路的激活，通过构建质粒发现LKB1可以抑制Hh信号通路的激活，抑制肺癌的增殖，使用环丙胺可使LKB1表达增加，进一步抑制肺癌细胞增殖并诱导其凋亡，进而证明了LKB1在非小细胞肺癌中抑制肿瘤的重要性[25]。非小细胞肺癌的增殖、转移和耐药均与Hh通路的激活密切相关，因此迫切需要验证新的与Hh通路相关的生物标记物，来进一步揭示Hh通路在NSCLC中的调控机制。

4 NSCLC生物治疗进展

NSCLC的治疗已经取得了很大的进展。化学疗法和目前针对EGFR的靶向治疗相结合的方法大大提高了NSCLC患者对药物的反应率，但耐药和复发的发生仍使得患者5年生存率很低[26]。有一项针对3 042例NSCLC患者调查显示，68 %的患者对卡铂产生耐药，63 %对顺铂耐药。另有研究证明，分别有75 %、63 %、72 %、42 %、40 %、52 %和31 %的患者对阿霉素、依托泊苷、吉西他滨、长春瑞滨、紫杉醇、多西他赛和托泊替康产生耐药性[27]。故而探索潜在的靶向药物和新的化合物是非常重要的。

环巴胺是第一个被发现可以抑制Smo的植物碱，实验表明可以有效抑制Hh通路上游组分，具有抑制非小细胞肺癌增殖并诱导其凋亡的作用[28]。随着研究进展发现，一方面Hh通路具有调节肿瘤干细胞增殖和分化作用，在CSCs的致癌性和耐药性中起关键作用。Yang B等人发现阿帕替尼可通过抑制Hedgehog和Wnt等信号通路，从而抑制肺癌的肿瘤干细胞，从而抑制非小细胞肺癌细胞的生长[28]。环索奈德是FDA批准的一种糖皮质激素(GC)，用于治疗哮喘和过敏性鼻炎。最近研究发现环索奈德通过调节Hh通路进而起到抑制肺癌细胞的增殖和CSCs的生长。环索奈德可降低肺癌细胞中Gli1、Gli2和平滑 (Smo) 的蛋白表达，同时也可以降低SOX2的转录和蛋白水平，为靶向Hh信号和SOX2预防肺CSC的形成提供了新的药物方案[28]。Bora-Singhal等人研究发现组蛋白去乙酰化酶11(HDAC11)受到抑制或者缺失可显著减少非小细胞肺癌(NSCLC)来源的肿瘤干细胞的自我更新能力，并发现在肺癌组织中HDAC11呈高表达[29]。

另一方面，有学者研究发现通过联合用药可以有效改善非小细胞肺癌出现的耐药现象。研究学者通过培养EGFR-TKI 耐药非小细胞肺癌细胞系，并在体外通过吉非替尼、阿法替尼或奥西美替尼维持体外耐药，从耐药细胞株中可检测到Hh通路的异常激活，使用 Smo抑制剂sonidegib和EGFR联合用药，使细胞系恢复对 EGFR-TKI 的敏感性[30]，进而有效的抑制非小细胞肺癌的增殖。还有学者发现奥西替尼可以有效的治疗EGFR突变的NSCLC患者，但也不可避免的发生耐药现象。在探讨其耐药机制过程中发现，从产生耐药患者肿瘤离体原代培养细胞中，发现Hh通路处于活化状态，在使用奥西替尼的同时，加用Smo抑制剂可显著抑制耐药细胞的增殖以及侵袭性，为临床提供了一种新型有效的治疗选择[31]。

经过不断的研究发现，生物治疗也可以减轻化疗引起的不良反应，并能有效的抑制耐药性的出现。作为传统中草药之一，黄芩提取液(SBE)在单独或与常规化疗方案联合使用，对多种恶性肿瘤有抑制作用。Wei-Wei Chen等人通过对非小细胞肺癌的研究发现，SBE通过下调Hh通路，从而增加NSCLC细胞对顺铂(DDP)敏感性，并通过干扰SOX2/SMO/GLI1互作环，进而抑制NSCLC肿瘤干细胞的增殖，对NSCLC的增殖具有明显的抑制作用[32]。白藜芦碱(Jervine)简称Jer，是从藜芦根茎提取的生物碱，具有抗炎和抗癌作用。据报道，Jer可通过阻断Hedgehog信号通路，促进肿瘤细胞自噬性，对鼻咽癌具有抗肿瘤作用[33]。Lei W发现Jer还可抑制SHh、Ptch1、Smo和Gli1的表达，抑制NSCLC细胞的增殖，同时降低形成集落能力。此结果也通过构建A549荷瘤小鼠模型得到了验证，进一步证明Jer可以有效抑制Hh通路，进而抑制NSCLC肿瘤的生长[34]。Jo E等人发现虫草提取物可降低NSCLC细胞的活力。虫草是一种寄生真菌，在我国视为珍贵的草药，具有免疫调节、抗炎和抗癌的作用，其机制是虫草抑制SMO/PTCH1信号传导，进而抑制Gli1转录活性，导致Bcl-2和Bcl-xl下调，诱导NSCLC细胞凋亡。虫草有望成为治疗NSCLC的潜在靶向药物[35]。随着对生物制剂的不断探索与发现，生物制剂有望成为治疗NSCLC的潜在药物。

5 展望

综上所述，肺癌的治疗仍是当今的肿瘤科医生的巨大挑战，特别是其中发病率较高的NSCLC。NSCLC在疾病的早期治疗效果好，但因具有隐匿性特点，使患者诊断出肺癌时肿瘤已经处于进展期。目前诊疗NSCLC的方式主要包括外科手术、放射治疗、化学疗法和靶向药物治疗，特别是近年来靶向药物治疗疗效取得了很大的进展，但耐药性的出现又一次增加了治疗难度，故仍需在 Hh 通路中寻找可能的NSCLC预测因子和治疗位点，不断揭示Hh通路在NSCLC中的分子机制。随着生物治疗的不断发展，因具有调节Hh通路的特点，在NSCLC的治疗中以其抑制肿瘤和减毒增敏的特点，逐渐体现其优势，为未来提供个体化治疗提出又一新的方案，同时也为患者提供了希望。