梅毒血清固定患者外周血Th1，Th2，Treg和Th17相关细胞因子检测

温 晶 李 珍 赵 伟 李富容 侯建玲 李中伟 郑荣涛 田洪青

山东第一医科大学附属皮肤病医院(山东省皮肤病医院，山东省皮肤病性病防治研究所)，山东济南，250022

梅毒血清固定亦称血清抵抗，是比较棘手的临床难题，目前还没有明确定义。中国中西医结合皮肤性病专业委员会认为，梅毒患者经规范的抗梅毒治疗和充分随访(一期梅毒随访1年、二期梅毒随访2年、三期梅毒随访3年)，非梅毒螺旋体血清学试验维持在一定滴度(一般在≤1∶8，部分>1∶8)超过 3个月，排除再感染、神经梅毒、心血管梅毒和生物学假阳性等，即为梅毒血清固定[1]。郑和国等[2]报道一期梅毒血清固定发生率为4.35%，二期梅毒为11.88%。与梅毒的类型和病期、血清初始滴度、是否经过规范治疗、是否为复发或再感染、体内是否存在潜在病灶、机体免疫情况等均有关系。血清固定的发生机制目前尚不十分清楚。有研究表明，梅毒血清固定患者体内存在Th1/Th2型以及Treg/Th17型细胞因子失衡，导致机体产生免疫抑制，进而降低机体免疫对病原体的清除能力，造成梅毒病程的迁延。本研究选取了Th1型代表细胞因子IFN-γ、IL-2、和IL-12，Th2型代表细胞因子IL-4、IL-10和IL-6；Th17型代表细胞因子IL-17和IL-22；调节性T细胞(Treg)型代表细胞因子TGF-β为对象，研究分析其在梅毒血清固定组、新发梅毒组、梅毒治疗后转阴组和对照组外周血中的浓度，探讨梅毒血清固定的发生与机体免疫功能异常的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 研究对象为2012年6月至2016年10月就诊于我院性病门诊的120例梅毒患者，分为三组：梅毒血清固定组、新发梅毒组、梅毒治疗后转阴组，另根据配对原则选取30名同时间段内健康体检者作为正常对照组。梅毒血清固定组入选标准为:已接受过规范的驱梅治疗，无临床症状或治疗后临床症状消失，并经脑脊液常规、生化及TRUST等检测排除神经梅毒，TRUST仍持续阳性，持续时间定为2年以上。新发梅毒组入选标准：综合流行病学史、临床表现及实验室检查(TPPA/TRUST/PCR等)结果，梅毒确诊病例均符合梅毒诊断标准。梅毒治疗后转阴组入选标准:患者经梅毒正规治疗后TRUST试验转阴。剔除标准：①HIV抗体检测阳性；②患有自身免疫性疾病或其他感染性疾病者；③妊娠、哺乳期妇女；④追踪期间有不洁性生活史者等。组间临床资料经对比并未发现有统计学差异(P>0.05)，具有可比性。本研究符合医院伦理委员会要求。所有人员均表示自愿配合本研究。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器和试剂 IFN-γ、IL-2、IL-12(P70)、IL-4、IL-10、IL-6、IL-17、IL-22和TGF-β ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)、微孔振荡器、电热恒温培养箱(上海精宏试验设备有限公司)、TPPA试剂盒(富士株式会社)、TRUST试剂盒(上海荣盛)等。

1.2.2 标本采集 收集梅毒血清固定患者、梅毒治愈患者、梅毒新发患者、健康体检者外周血标本分离血清-20℃冰箱内冷存。

1.2.3 对所有标本进行TPPA、TRUST、HIV、肝肾功能等检测，操作均严格按照操作规则进行。

1.2.4 细胞因子水平的检测 (1)加样：取出预先包被封闭好的96孔板，分别加入100 μL稀释好的标准品和稀释好的样品，37℃孵育 90 min。(2)吸板：吸干酶标板内反应液，在对着吸水纸拍几下，不洗。(3)加生物素标记抗体：加入100 μL按1∶100稀释好的生物素标记的抗体，37℃孵育60 min。(4)洗板：1X洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1 min。(5)加过氧化物酶标记的亲和素(ABC)：加入100 μL按1∶100稀释好的ABC，37℃孵育30 min。(6)洗板：1X洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡90 s。(7)加入底物(TMB)：每孔90 μL TMB，37℃孵育避光孵育20 min。(8)加终止液：每孔100 μL终止液，轻柔混匀。(9)读板：根据酶标仪器操作方法，上机检测OD值(450 nm 处)，通过软件(ELISACalc)计算获得所测物质的浓度。

2 结果

2.1 一般资料 梅毒血清固定组：30例，其中男12例，女18例；年龄21～48(32.6±8.6)岁；一期梅毒3例，二期梅毒7例，隐性梅毒20例；初始滴度分别为RPR≤1∶2(11例)、RPR 1∶4～1∶8(3例)、RPR≥1∶16(16例)。新发梅毒组：30例，其中男14例，女16例；年龄19～50(36.8±10.3)岁；一期梅毒4例，二期梅毒11例，隐性梅毒15例。转阴组：30例，其中男13例，女17例；年龄21～51(32.3±8.7)岁。对照组：30例，血清TRUST，TPPA及HIV均阴性的健康查体者,其年龄、性别等构成比相匹配。

2.2 Th1型和Th2型细胞因子表达情况 梅毒血清固定组与新发梅毒组、转阴组以及对照组相比，Th1型细胞因子IFN-γ(P=0.005、0.04、0.004)，IL-2(P=0.049、0.000、0.014)和IL-12(P=0.021、0.046、0.030)水平均明显较低，差异均有统计学意义。但Th2型细胞因子IL-4(P=0.004、0.012、0.007)和IL-10(P=0.000、0.001、0.000)水平均明显较高，差异有统计学意义；而对于IL-6，仅表现出血清固定组IL-6仅比对照组显著较高(P=0.025)(表1)。

表1 Th1,Th2,Treg和Th17相关细胞因子在各组人群外周血中的浓度

2.3 Tregs和Th17型细胞因子表达情况 结果显示，梅毒血清固定组的TGF-β与新发梅毒组、转阴组以及对照组相比均明显较高(P=0.005、0.013、0.032)，而血清固定组IL-17仅显著低于新发梅毒组、转阴组(P=0.01、0.007)，IL-22显著低于新发梅毒组(P=0.023)(表1)。

3 讨论

2019年全国梅毒报告535819例，胎传梅毒1934例。1995-2016年，中国每年新发梅毒确诊数量从11336例增加至438199例，梅毒总发病数量由每1.0/105增加到32.2/105[3]。伴随中国梅毒的发病率迅速增长的同时，血清固定的发病率也明显上升。李军等[4]报道一期梅毒血清抵抗发生率为8.7%，二期梅毒为20.3%，潜伏梅毒患者为42.2%。Sea等[5]发现约有15%～41%的梅毒患者会发生血清固定。梅毒血清固定发生与诸多因素有关，如梅毒的分期、血清初始滴度和是否进行规范治疗等。一旦进入血清固定，重复治疗对降低血清非特异性抗体滴度影响不大[6]。研究表明，如果治疗初期机体能发生针对梅毒螺旋体强有力的促炎性免疫反应，那么能发生血清固定的几率会低很多[7]。

Veldhoen等[8]1986年首次依据细胞分化、功能特征和其产生细胞因子的不同，将特异性CD4+Th细胞细分为Th1和Th2细胞，Maggi等[9]又在1991年证实人类存在Th1和Th2亚群。Th1细胞主要分泌IL-2，IL-12和IFN-γ等细胞因子，介导细胞免疫反应。Th2细胞主要分泌IL-4，IL-10和IL-6等细胞因子，介导体液免疫反应[10]。Leader等[11]发现梅毒患者免疫状况早期以Th1型细胞因子为主，Th1占优势。徐刚等[12]研究显示，梅毒血清固定患者的Th1型细胞因子IL-2和IL-12明显低于健康组和治愈组(P<0.05)；但其Th2型细胞因子IL-10又明显高于健康组和治愈组(P<0.05)。本研究结果显示，梅毒血清固定组与新发组、转阴组相比，Th1型细胞因子IFN-γ，IL-2和IL-12水平均显著较低(P<0.05)，其中IL-2可刺激NK细胞增殖，激活杀伤细胞的效应功能；IL-12可促进T细胞和NK细胞增殖并增强其活性，同时可诱导IFN-γ的产生，使免疫反应朝向Th1型方向发展，并抑制IL-4的产生。但Th2型细胞因子IL-4和IL-10水平均显著较高(P<0.05)，其中IL-4可刺激活化B细胞和T细胞增殖；IL-10可促进体液免疫，抑制细胞免疫，使Th1/Th2细胞达到平衡[2]。另外本研究发现梅毒血清固定组的IL-6与新发组无显著差异，但与对照组相比有显著差异(P<0.05)。IL-6细胞因子属于IL-6家族，不但是Th2型典型细胞因子，还是一种促炎细胞因子，一种瞬间高温细胞因子，会伴随着青霉素的杀菌作用而产生，同样在调节Treg和Th17细胞的分化也有重要作用[15]。

随着研究的深入，来源于幼稚CD4+T细胞的另外两种Th细胞亚群，即调节性T细胞(Tregs)和Th17细胞再度引起广泛关注。Tregs细胞能够下调机体免疫应答的水平，减轻对机体组织的损伤以维持自身耐受，发挥免疫抑制作用；而Th17细胞恰恰相反，是最早参与抗感染免疫的效应T细胞，可以通过IL-17细胞因子而发挥抗感染作用，并促进炎症反应过程。Tregs/Th17动态平衡同样对维持机体适应性免疫内环境的稳定起着重要作用[13]。Zhao等[14]研究提出，如果患者体内Tregs/Th17细胞平衡状态异常，就会造成免疫抑制，减弱了机体对梅毒螺旋体的控制，从而导致血清固定。本研究显示，梅毒血清固定组的TGF-β显著高于转阴组、对照组(P<0.05)，而IL-17和IL-22则相反。机体内TGF-β的分泌水平会显著影响Treg和Th17细胞的分化发育方向，伴随着患者体内TGF-β的升高，导致细胞分化偏向于Treg细胞，造成Th17细胞的反馈性减少。

综上所述，本研究发现无论是Th1细胞/Th2细胞，还是Treg细胞/Th17细胞，在机体内相互作用构成复杂的免疫网络，而各种细胞因子之间同样是相辅相成，亦或是此消彼长，从而影响到机体对病原体的免疫应答程度。一旦上述平衡被破坏，造成机体免疫应答的紊乱，有可能导致一部分梅毒螺旋体逃过机体免疫监视，致使梅毒感染进入慢性阶段，而在临床上表现为血清固定。从而推测无论是Th1/Th2，还是Treg/Th17的失衡在梅毒患者体内也许是普遍现象，只是血清固定患者的失衡现象更加明显。