绿盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆、抗体制备及在蜕皮激素诱导下的应答

谭永安，赵旭东，姜义平，赵静，肖留斌✉，郝德君✉

1江苏省农业科学院植物保护研究所，南京 210014；2南京林业大学南方现代林业协同创新中心/林学院，南京 210037

0 引言

【研究意义】绿盲蝽（Apolyguslucorum）属半翅目（Hemiptera）盲蝽科（Miridae），寄主范围广泛，可危害棉花等多种经济作物[1-2]。20世纪90年代末以来，由于Bt棉的大面积推广种植和农业产业结构的调整，绿盲蝽种群数量急剧上升，已成为棉田主要害虫，并迅速波及枣树、葡萄、樱桃、桃等多种果树，严重影响其产量及品质。生产上对化学农药的长期依赖势必会导致绿盲蝽的抗药性日渐增强，从而造成防治效果下降[3-4]。因此，目前绿盲蝽防控面临严峻挑战，亟需开拓基于新靶标的有效防控技术。【前人研究进展】雷帕霉素靶蛋白 （target of rapamycin，TOR）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞代谢、生长及增殖方面至关重要[5-6]。TOR可分为TOR复合物1（TOR complex 1，TORC1）和 TOR 复合物 2（TOR complex 2，TORC2）。TORC1是 TOR与 RapTOR（regulatory associated protein of mTOR）及mLST8（mammalian lethal with Sec13 protein 8）形成的一个对雷帕霉素敏感的复合物，可调控细胞内蛋白质翻译、细胞凋亡及细胞周期等关键生理过程[7-8]。TORC2是由 RicTOR（rapamycin insensitive cornpanion of mTOR）、Sinl（也称为 Mip1）与 mLST8、mTOR共同形成的对雷帕霉素不敏感的复合物，通过调控蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）和蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）的活化，主要参与细胞极性、空间及骨架结构的形成[9]。在昆虫中，TOR可通过直接耦合前胸腺中的营养感应，从而在蜕皮激素（20E）生成及蜕皮过程中发挥重要作用[10-11]。研究表明，抑制 TOR的表达可造成幼虫发育历期延长，同时与蜕皮激素合成相关基因的表达量下调，表明昆虫在生长发育以及蜕皮变态时需要TOR的参与；此外，在幼虫营养缺乏的条件下，TOR信号的激活会诱导蜕皮激素的生成，使幼虫完成正常蜕皮及变态行为[12]。TOR信号也可受蜕皮激素的调控[13-14]。对黑腹果蝇（Drosophilamelanogaster）的研究发现，当幼虫摄入营养时，蜕皮激素抑制TOR信号介导调控胰岛素样肽（ILP）生成胰岛素分泌细胞来调控果蝇的生长发育[15-16]。【本研究切入点】目前对于TOR的研究多集中在植物、哺乳动物及一些模式昆虫上[17-19]，对绿盲蝽AlTOR的相关研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】采用RACE技术从绿盲蝽中扩增AlTOR全长，运用生物信息学方法对该基因进行结构分析和同源进化分析，并利用qRT-PCR阐明其时空表达动态及20E对其表达的影响，同时将其在原核细胞中进行高效表达，筛选最佳表达条件，以获得纯化蛋白，最后制备特异性的抗体，为在蛋白水平进一步研究该基因的功能打下基础。

1 材料与方法

试验于2018年9月至2019年12月在江苏省农业科学院植物保护研究所完成。

1.1 供试昆虫

绿盲蝽于 2018年采自江苏沿海棉区的大丰市蚕豆田（33.11°N，120.25°E），室内用新鲜四季豆（Phaseolusvulgaris）续代饲养，饲养条件为温度（27±0.5）℃，相对湿度（70±5）%，光周期 14L∶10D。

1.2 主要试剂及仪器

RNA提取试剂盒（Promega），M-MLV反转录试剂盒（Promega），BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（宝生物工程（大连）有限公司），pCzn1表达载体、PFU DNA聚合酶（南京钟鼎生物技术有限公司），TOP10菌株（天根生化科技有限公司），大肠杆菌（Escherichiacoli）Arctic Express（DE3）（Agilent）；卡那霉素、咪唑、尿素（上海生工生物工程有限公司）；限制性内切酶（TaKaRa），Protein Marker（Thermo），IPTG、Acr、Bis、Tris（Sigma），SDS（Amresco），TEMED（BIO-RAD），高糖、Tyrptone、Yeast Extract（OXOID），Agarose（上海赛百盛基因技术有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。Ni2+IDA亲和层析胶（Novagen），HexIOS分光光度计、Allegra 21R台式高速冷冻离心机（Beckman），台式高速离心机（Sorval），Biologic LP层析系统、Mini Protean II垂直平板电泳系统、水平电泳系统（BIO-RAD），PTC-200基因扩增仪（MJ Research），20E、U73211（Sigma）。

1.3 AlTOR全长基因的克隆

基于实验室构建的绿盲蝽转录组数据及已报道昆虫TOR进行BLAST搜索，筛选绿盲蝽转录组中可能的TOR基因片段序列，从而进行克隆验证。根据获得的序列设计特异性引物（表1），进行AlTOR5′和3′端序列的克隆。取绿盲蝽3龄若虫20头，Trizol法提取总RNA后合成cDNA第1链，根据设计的特异性上游引物和下游引物，进行AlTOR5′和3′端序列的克隆。5′端序列的克隆采用巢式PCR，第一轮反应体系：10×PCR 缓冲液 5.0 μL、25 mmol·L-1MgCl23.0 μL、10 mmol·L-1dNTP Mix 1.0 μL、10 μmol·L-15′-AlTOR-1 2.0 μL、10 μmol·L-1通用引物 Abridged Anchor Primer 2.0 μL、cDNA 5.0 μL、Taq DNA 聚合酶 0.5 U，超纯水补足至50.0 μL；第二轮反应体系：10×PCR缓冲液 5.0 μL、25 mmol·L-1MgCl23.0 μL、10 mmol·L-1dNTP Mix 1.0 μL、10 μmol·L-15′-AlTOR-2 1.0 μL、10 μmol·L-1通用引物 Abridged Universal Amplification Primer 1.0 μL、第一轮 PCR 产物 5.0 μL、Taq DNA聚合酶0.5 U，超纯水补足至50.0 μL；PCR反应条件：预变性 94℃ 2 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循环35次，72℃延伸7 min。3′端序列的克隆也采用巢式PCR，第一轮反应体系：PCR-Grade Water 34.5 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 5.0 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 1.0 μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL，cDNA 2.5 μL，10 μmol·L-13′-AlTOR-1 1.0 μL，10×UPM 5.0 μL，超纯水补足至50.0 μL；第二轮反应体系：PCR-Grade Water 34.5 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 5.0 μL，10 mmol·L-1dNTP Mix 1.0 μL，50×Advantage 2 Polymerase Mix 1.0 μL，第一轮 PCR 产物 2.5 μL，10 μmol·L-13′-AlTOR-2 1.0 μL，10×UPM 5.0 μL，超纯水补足至50.0 μL；PCR 反应条件：预变性 94℃ 2 min，94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 1 min，循环30次，72℃延伸7 min。将获得的5′和3′端及保守区域进行拼接和测序（上海生工生物工程有限公司），最终获得AlTOR全长。最后根据测序结果，设计全长基因克隆引物（AlTOR-F和AlTOR-R），进行AlTOR全长基因的克隆。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primer sequences used in this study

1.4 AlTOR时空表达定量检测

收集绿盲蝽不同日龄若虫及羽化7 d后雌成虫的不同组织（头、胸、翅、足、中肠、卵巢和脂肪体）。其中不同日龄样本每个处理15头，不同组织样本每个处理10头雌成虫，并设计3个生物学重复，每个生物学重复设置3个技术重复。液氮处理样品后-80℃冰箱保存备用。Trizol法提取总RNA，Prime ScriptTMRT Master Mix反转录合成cDNA，-20℃保存。qRT-PCR试验步骤按照SYBR Premix Ex Taq Kit说明书上进行。所用的AlTOR引物参见表1，并以绿盲蝽持家基因β-actin为内标对照基因[20]（GenBank登录号：JN616391）。扩增体系：UltraSYBR Mix 12.5 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA 模板 2 μL，ddH2O 9.5 μL；扩增条件：95℃预变性5 min，然后95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，循环40次。

1.5 20E处理绿盲蝽若虫

分别用 20E（2 μmol·L-1）、U73122（20E 抑制剂[21]，50 μmol·L-1）、20E+U73122 处理、乙醇（CK）浸泡切除两端的四季豆1 min，晾干后饲喂初孵1龄若虫。每处理绿盲蝽400头，重复4次。按1.4方法收集绿盲蝽不同发育阶段和不同组织样本后，分析不同处理AlTOR表达量。

1.6 AlTOR序列分析与进化树分析

AlTOR核苷酸序列分析使用 Expasy在线程序（http://web.expasy.org/compute_pi/）进行预测分析，蛋白结构域分析运用SMART在线分析（http://smart.embl-heidelberg.de/）；氨基酸序列比对软件使用ClustalX进行；利用 MEGA 6.0软件包中的邻接法（neighbor-joining，NJ）构建进化树，并1 000次重复构建。

1.7 AlTOR在大肠杆菌中的表达

使用 DNASTAR-Protean软件分析 AlTOR蛋白Antigenic index，选取抗原性较好的区域（72—381，蛋白质理论分子量为35.83 kD）作为免疫原区域，使用原核表达获得抗原蛋白。基于 PAS（PCR-based accurate synthesis）的方法，在引物的两端各设计保护性碱基合成基因6731-2S，将其连入pCzn1重组质粒用限制性内切酶EcoR I及XhoI双酶切后进行连接。酶切体系：两种限制性内切酶各0.25 μL，10×Buffer缓冲液1.0 μL，带有合适酶切位点的基因片段3 μL，用ddH2O补足至10 μL，37℃水浴3 h。连接体系：酶切回收后的载体5.0 μL，基因片段10.0 μL，T4 DNA连接酶 1.0 μL，10×Buffer缓冲液 2.0 μL，用 ddH2O补足至20 μL，16℃反应12—16 h。

连接产物转化大肠杆菌TOP10后采用PCR筛选阳性克隆。将鉴定正确的重组质粒pCzn1-AlTOR转化到大肠杆菌Arctic Express感受态细胞，具体方法：将质粒1 μL加入100 μL感受态细菌中，置冰上20 min；42℃热激90 s，迅速置冰中5 min，加入600 μL LB培养液；37℃，220 r/min振摇1 h，离心后全部涂布于含50 μg·mL-1Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜。挑取转化平板上的多克隆接种于含50 μg·mL-1Amp的3 mL LB培养液的试管中，37℃ 220 r/min振摇过夜。次日按1∶100接种于50 μg·mL-1Amp的30 mL LB培养液中，37℃ 220 r/min 振摇至菌体 OD600为 0.6—0.8。取出1 mL培养物，10 000 r/min室温离心2 min，弃上清，用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5 mmol·L-1，20℃ 220 r/min振摇过夜，诱导融合蛋白表达。取出1 mL培养物，10 000 r/min室温离心2 min，弃上清，用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4 000 r/min，离心10 min，弃上清，用PBS重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀液加入上样缓冲液重悬。12% SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显带。

1.8 包涵体蛋白的变性和复性

先将菌体沉淀重悬于20 mL裂解液（20 mmol·L-1Tris-HCl containing 1 mmol·L-1PMSF，pH 8.0）中，超声破碎（功率400 W，工作4 s，间歇8 s，共20 min），收集沉淀。使用包涵体洗涤液（20 mmol·L-1Tris，1 mmol·L-1EDTA，2 mol·L-1尿素，1 mol·L-1NaCl，1%Triton X-100，pH 8.0）洗涤包涵体3次。再使用溶解缓冲液（20 mmol·L-1Tris，5 mmol·L-1DTT，8 mol·L-1尿素，pH 8.0），溶解包涵体，4℃过夜。室温，10 000 r/min离心 15 min，将上述溶液滴加缓冲液（20 mmol·L-1Tris-HCl，0.15 mol·L-1NaCl，pH 8.0），逐步成倍梯度稀释缓慢搅拌，将蛋白溶液装入透析袋于上述缓冲液中透析过夜。

1.9 融合蛋白的Ni柱亲和纯化

利用低压层析系统，包涵体溶液以 0.5 mL·min-1流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱，Ni-IDA Binding-Buffer以 0.5 mL·min-1流速冲洗，至流出液 OD280值到达基线，再用Ni-IDA Washing-Buffer（ 20 mmol·L-1Tris-HCl，20 mmol·L-1咪唑，0.15 mol·L-1NaCl，pH 8.0）以1 mL·min-1流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；用 Ni-IDA Elution-Buffer（20 mmol·L-1Tris-HCl，250 mmol·L-1咪唑，0.15 mol·L-1NaCl，pH 8.0）以1 mL·min-1流速洗脱目的蛋白，收集流出液；上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用Ni-IDA Elution-Buffer进行透析过夜；12% SDS-PAGE分析后利用BSA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

1.10 AlTOR多克隆抗体的制备

取纯化的AlTOR重组蛋白免疫新西兰白兔 （江苏省农业科学院兽医研究所提供）。皮下注射，每次免疫量为400 μg，2—3周免疫一次，共免疫4次。第4次免疫后在大白兔颈动脉采血，8 000 r/min离心8 min所得上清制备抗血清并准备纯化抗体。TOR蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱，将PBS与所得抗血清等量混合后缓慢上样，待抗体抗原结合后用甘氨酸洗脱缓冲液洗脱得到所需纯化抗体，并在PBS缓冲液 （pH 7.4）中进行透析过夜（4℃），隔日进行效价测定，BCA浓度测定试剂盒对所得抗体进行浓度测定。

1.11 效价测定

间接 ELISA法对抗体进行效价测定。以纯化的AlTOR重组蛋白（5 g·mL-1）包被ELISA板，每孔加入 100 mL，4℃过夜。用 PBST（0.2 g KCl，0.2 g KH2PO4，2.9 g NaHPO4·12H2O，8 g NaC1，0.05%Tween-20，pH 7.4）洗涤3次，加入PBST封闭液（含5%牛血清白蛋白）于37℃封闭2 h。取出酶标板，弃去内液，用PBST洗板3次，加入用PBST连续倍比稀释的AlTOR多克隆抗体和阴性血清每孔100 μL，37℃恒温箱1 h。同上洗涤后，加入100 μL的用PBST以1∶5 000稀释的二抗HRP-IgG，37℃放置1 h。用PBST洗板3次，每次5 min，最后加100 μL TMB底物液显色，37℃显色15 min，待终止反应后，酶标仪测定A450值。

1.12 AlTOR多克隆抗体的鉴定

检测多克隆抗体的特异性Western blot测定按照SONG等[22]的方法进行并稍作修改。将原核表达的AlTOR重组蛋白及 3龄绿盲蝽若虫总蛋白进行SDS-PAGE分析。转印PVDF膜后封闭，一抗为上述制备的蛋白抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠HRP。

1.13 数据分析

不同处理的AlTOR相对表达量变化以 2-ΔΔCt[23]计算。差异显著性采用统计软件 SAS 8.0中的 Duncan氏新复极差法进行分析。

2 结果

2.1 AlTOR的克隆及序列分析

利用绿盲蝽转录组筛选AlTOR基因序列，再利用 RACE方法，分别进行 5′和 3′末端的扩增，获得了AlTOR的全长序列（图1）。序列分析结果表明，AlTOR全长1 652 bp，包括一个208 bp的5′非翻译区以及136 bp的3′端非翻译区。AlTOR开放阅读框含有1 308 bp的核苷酸，编码435个氨基酸，理论等电点预测为7.16。结构域分析表明，AlTOR基因翻译后的氨基酸序列具有典型的 TOR特征，含有 N-末端的SIN1结构域（288 bp）、高度保守的CRIM结构域（390 bp）及脂质与膜结合相关C-末端的PH域（363 bp）（图2）。

2.2 多重联比及进化树分析

多重联比结果如图3所示，TOR在半翅目昆虫中较为保守，尤其是CRIM结构域，AlTOR的氨基酸序列与半翅目臭虫科温带臭虫（Cimexlectularius）以及蝽科茶翅蝽（Halyomorphahalys）的TOR氨基酸序列一致性相对较高，分别为 55.78%和 54.38%，与其他昆虫的TOR基因序列一致性较低，如膜翅目的造纸胡蜂（Polistesdominula）（38.70%）及芜菁叶蜂（Athalia rosae）（39.33%）。

利用MEGA 6.0软件NJ法构建了包括绿盲蝽在内的5个目20种昆虫TOR的系统进化树（图4）。结果显示，TOR作为高度保守的蛋白，在种间同源性较高；外聚群中，膜翅目、鳞翅目、蜚蠊目、缨翅目中聚类更为接近，属于同一类分支。半翅目中，绿盲蝽与温带臭虫、茶翅蝽同源性较高，亲缘关系较为接近；与蚜虫位于不同分支，同源性远低于同为半翅目的温带臭虫和茶翅蝽。

2.3 AlTOR在绿盲蝽不同发育阶段及组织中的表达

AlTOR在绿盲蝽1—16日龄虫体中均有表达，表达量呈现波动式下降趋势，其中在初孵若虫（1日龄）表达量最高，8日龄若虫表达量最低，此外，AlTOR在绿盲蝽各龄期蜕皮时表达量显著升高（图5）。AlTOR在绿盲蝽雌成虫各组织中均有表达，其中在卵巢、中肠和脂肪体中高表达，而在头、胸、足中表达量较低，AlTOR的表达具有组织特异性（图6）。

2.4 不同处理对AlTOR相对表达量的影响

与CK（乙醇）相比，当绿盲蝽分别发育至1龄蜕皮及2龄蜕皮时（4 d和6 d），20E显著上调AlTOR的表达；U73122处理后，AlTOR的表达呈现先上升后下降的趋势；此外，20E+U73122混合处理后，AlTOR的表达总体变化不大（图7）。与CK（乙醇）相比，20E处理绿盲蝽雌成虫后，各组织中AlTOR表达均显著上调，其中头、翅、卵巢和脂肪体中基因表达量分别显著提高了200.00%、118.89%、20.53%和60.82%；而当 U73122处理后，绿盲蝽雌成虫的头、翅和足中AlTOR显著上调，中肠、卵巢和脂肪体中AlTOR表达量则下调（图8）。

2.5 重组蛋白AlTOR的表达、复性及纯化

重组质粒命名为pCzn1-AlTOR。随后将其转化至大肠杆菌Arctic Express(DE3)表达菌株中，经0.5 mmol·L-1IPTG 20℃诱导 12 h 后，12% SDS-PAGE检测分析发现，pCzn1-AlTOR重组质粒表达一个约36 kD的蛋白（图9-A）。而不经IPTG诱导的重组质粒无此蛋白表达，说明AlTOR可在大肠杆菌细胞中诱导表达。但诱导表达的pCzn1-AlTOR表达蛋白均分布在沉淀体中，上清液中几乎没有，说明pCzn1-AlTOR表达蛋白主要以包涵体形式存在。包涵体经体外溶解、复性后，利用SDS-PAGE电泳分析pCzn1-AlTOR表达蛋白的纯化情况。用含 20 mmol·L-1咪唑的缓冲液洗脱包涵体，进一步复性和纯化后在36 kD附近仅出现一条明显的特异性条带未见其他条带，说明已得到纯化的靶蛋白（图 9-B）。采用蛋白定量试剂盒测定该蛋白的浓度为 0.2 mg·mL-1，SDS-PAGE电泳检测该抗体的纯度达到85%以上，并最终获得了5.46 mg抗体，可以进行后续多克隆抗体制备工作。

2.6 AlTOR蛋白多克隆抗体的特异性鉴定

新西兰白兔经3次免疫后，用间接ELISA法检测多克隆抗体的效价。AlTOR多克隆抗体和阴性血清（免疫前健康兔血清）按500×20—500×210连续倍比稀释。结果表明当AlTOR抗体稀释5 120倍时，OD阳性/OD阴性＞2.0，其终效价可达1∶512 000。用制备的多克隆抗体分别检测原核表达的 AlTOR重组蛋白及刚蜕皮的绿盲蝽3龄若虫，Western blot分析表明，所制备的多克隆抗体不仅能与绿盲蝽总蛋白结合，还可特异性与AlTOR重组蛋白反应（图10），且条带大小与预测的蛋白质大小一致，说明制备的AlTOR多克隆抗体准确、有效。

3 讨论

TOR是一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶，是真核细胞响应环境信号调控生长和代谢的关键因子[6]。自TOR蛋白在酵母细胞发现后，在其他真菌、昆虫、植物以及哺乳动物中也相继被发现。TOR信号通路高度保守，对有机体自身生长和发展至关重要[24]。研究发现，植物、蠕虫、果蝇以及哺乳动物细胞中有一个TOR编码基因，而酿酒酵母中存在两个TOR编码基因[25]。TOR在细胞生长的营养调控中能通过激活下游信号通路，介导4E-BP1、S6K、eEF2等一系列翻译调节因子的磷酸化作用传递外界营养状况、生长因子等生长刺激信号，从而调节细胞内核糖体的发生及蛋白质的合成，进而综合调控细胞的生长与增殖[24]。另外，TOR还可参与调节真核细胞中mRNA和蛋白质的稳定性、细胞大小等与细胞生长密切相关的生理过程[26-28]。

本研究通过筛选绿盲蝽转录组数据，RACE法获得了AlTOR的全长基因序列。序列分析结果表明，AlTOR的开放阅读框含有1 308 bp的核苷酸，编码435个氨基酸。多序列比对结果显示与其他半翅目昆虫TOR的氨基酸序列一致性在 40%—60%，含有 TOR作用靶标相关的SIN1结构域、CRIM结构域以及PH结构域。SIN1结构域是哺乳动物mSIN1的同源物，也是TOR作用的靶标之一，在信号转导过程中起着重要的作用。CRIM结构域位于TOR蛋白的中间位置，对TOR识别底物有着重要作用；另外CRIM结构域不论是在酵母细胞还是哺乳动物体内都高度保守。PH结构域同样也十分保守，其主要与脂质与膜结合相关[28]。进化树结果显示半翅目、膜翅目、鳞翅目等昆虫的TOR较为分化，位于不同的分支上。分化的原因可能这些目昆虫种类繁多、变态类型及由于不同的自然选择压造成的，如膜翅目、鳞翅目类昆虫是完全变态类昆虫，而半翅目昆虫属于不完全变态类昆虫。

TOR是昆虫体内营养信号的中心，通过氨基酸（AA）作为其调节因子，对外界摄入营养进行感知。AA/TOR途径广泛存在于真核细胞中，如酵母细胞。研究表明，除了调控葡萄糖的合成，TOR还可以通过氨基酸控制类胰岛素样肽的合成以及分泌。在果蝇成虫中，胰岛素样肽的分泌是由脂肪体产生的未配对细胞因子2（cytokine unpaired 2）远程调控从而响应营养信号[15,29]。由此可见，由TOR发出的氨基酸信号代表着营养信号的第一阶段，特别是对于需要蛋白质来启动产卵的昆虫而言[30]。此外，TOR信号还参与雌性昆虫生殖产卵，其作为营养信号的中心为雌虫生殖以及产卵提供充足的能量供给[12]。本研究发现，AlTOR在1—16日龄绿盲蝽中均有表达，表达量呈现波动式下降趋势，以初孵若虫（1日龄）中表达量最高；此外AlTOR在绿盲蝽雌成虫各组织中均有表达，其中卵巢、中肠及脂肪体中高表达，表明AlTOR的表达存在组织和时空特异性。研究表明，雌性昆虫的生殖需营养及能量资源的投入，在大多数昆虫中，营养的摄取是启动卵发育的关键触发因素。而AA/TOR途径和胰岛素途径作为营养传感器，在昆虫繁殖中起着至关重要的作用，影响生殖组织形成并调控JH和20E的生物合成[31-33]。TOR可刺激卵黄原蛋白在脂肪体的合成并激活卵发育；相反地，TOR途径的失活会导致繁殖受到抑制。在埃及伊蚊（Aedesaegypti）以及褐飞虱（Nilaparvatalugens）中，通过雷帕霉素抑制TOR蛋白质的合成以及RNAi介导的TOR基因沉默都会抑制卵黄原蛋白的表达，从而导致生殖力的降低[34-35]。在本研究中，AlTOR在若虫蜕皮期以及成虫羽化期表达水平显著提高，暗示TOR可能参与绿盲蝽若虫蜕皮以及羽化的变态行为；且AlTOR在卵巢、中肠及脂肪体中高表达暗示TOR可能参与绿盲蝽的生殖活动，这也是后续需要进行的研究工作。TOR可在蜕皮激素生成以及昆虫蜕皮过程中发挥重要作用。同时，蜕皮激素也会抑制 TOR信号，在果蝇中，蜕皮激素会抑制幼虫进食时脂肪体内的TOR信号，进而产生未知信号，调节胰岛素生成细胞中胰岛素样肽的产生，从而控制果蝇全身性生长[32]。对家蚕的研究发现，蜕皮激素会在成虫的不同发育阶段在同一组织促进或抑制 TOR信号从而调控成虫的生长发育[36]。在本研究中，绿盲蝽若虫随着龄期的增加，20E会显著上调AlTOR的表达，卵巢和脂肪体中AlTOR的表达也会由于20E的刺激而显著提高，表明AlTOR可能受20E调控，尤其是在“能量中心”脂肪体以及“生殖中心”卵巢中。细胞膜上的磷脂酶C是参与20E信号转导的关键酶，磷脂酶C可水解磷酯酰肌醇二磷酸成为第二信使IP3和DAG传递激素，神经递质和生长因子等信号行使其功能[37]。GU等研究表明，TOR信号参与家蚕前胸腺中促前胸腺激素诱导的20E合成，且磷脂酶C参与这个过程，当使用U73122抑制磷脂酶C时，会导致20E的合成受阻[38-39]。在本研究中，20E抑制剂U73211处理后，AlTOR在中肠和脂肪体中表达量显著下降，而 20E处理后，AlTOR在中肠和脂肪体中表达量显著上调，暗示磷脂酶C可能参与20E对AlTOR的调控。

可溶性蛋白质的异源表达已经有较多的表达系统可用，目前很多可溶性蛋白以融合蛋白的形式得到成功表达[40-41]。本研究成功构建了pCzn1-AlTOR原核表达载体，并发现在20℃ 0.5 mmol·L-1IPTG诱导12 h的条件下可大量表达AlTOR蛋白，之后通过变性、复性、蛋白纯化获得了纯化的靶蛋白。通过免疫新西兰白兔4次之后，采血检测，ELISA方法确定抗血清针对TOR蛋白的效价，通过ELISA检测效价得出，TOR抗体效价在512 000左右，纯度在85%以上，获得纯化的抗体为5.46 mg。Western blot分析结果也表明该多克隆抗体可同时与绿盲蝽总蛋白及 AlTOR重组蛋白特异性结合，为进一步在蛋白层面研究TOR的功能打下了良好基础。

4 结论

AlTOR在绿盲蝽体内的表达谱显示出发育阶段特异性和组织特异性；20E及其抑制剂诱导后，AlTOR呈现出相反的应答反应；本研究获得的AlTOR重组蛋白的多克隆抗体具有高特异性。