应用环介导等温扩增技术快速检测血培养阳性瓶中的七种常见病原菌

尹小毛，希伦，王治伟*

(1. 广州医科大学附属顺德医院，广东 佛山 528315; 2. 南方医科大学医学检验系，广东 广州 510515)

血液感染(BSI)是临床常见的一类感染性疾病，其病原菌主要包括金黄色葡萄球菌、肠球菌和革兰氏阴性菌等，其中革兰氏阴性菌包括肠杆菌科细菌、假单胞菌和沙雷菌等[1,2]。血培养是主要针对菌血症、败血症等血液感染患者血液中的病原微生物进行鉴定的传统方法，为临床及时准确地制定抗感染治疗方案提供依据[3]。使用自动培养技术，在血液培养系统发出阳性信号后(通常大多数病原菌在培养48个小时内)，血培养瓶内的肉汤可用于革兰氏染色，然后再转种到固体培养基上，最后进行鉴定和药敏试验。这一过程从血培养瓶报阳后开始计算需要24到48小时[3,4]。众所周知，脓毒血症是一种临床急症，对于脓毒血症患者，适当的抗菌治疗每延迟1小时，死亡率就会增加1倍[5-7]。因此，缩短病原菌鉴定时间对于提高血液感染治疗效果有着非常重要的意义。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年由日本学者Notomi等开发的一种新型的核酸扩增技术，主要针对靶基因的六个不同区域设计四种特异性引物，在60～65 ℃的恒温条件下(60～65 ℃是双链DNA复性及延伸的中间温度，DNA在65 ℃左右处于动态平衡状态)依靠高活性链置换DNA聚合酶在短时间内对DNA进行自我循环扩增[8]。LAMP扩增效率达109～1010，比PCR高出1～2个数量级；因有4～6个特异性引物识别，该技术比传统的PCR有更高的特异性；且其反应时间比PCR要短，在恒温条件下1 h内即可完成，加入一对额外的环引物[9]，可使其反应时间缩短至半小时[10-11]。因LAMP有“简便、快速、精确、低价”等优点，近年来已被广泛应用于病毒、细菌、寄生虫等各种病原体的检测[12-13]。

采用传统的培养鉴定方法，微生物鉴定的报告时间一般为血培养阳性后1～3 d，而采用LAMP技术能在血培养标本报阳后的1～2个小时内快速鉴定病原菌，从而能帮助临床医生迅速针对检测到的病原菌采取相应的抗生素治疗。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

梅里埃BacT/ALERT血培养仪(法国梅里埃)、血培养瓶(包括普通需氧血培养瓶、普通厌氧血培养瓶、中和需氧血培养瓶、中和厌氧血培养瓶、儿童血培养瓶，法国梅里埃)、Vitek2全自动细菌鉴定仪(法国梅里埃)生物安全柜HFsafe -1200B2型(上海力康)、MX-F型漩涡混合仪(北京大龙)、白洋高速冷冻离心机(北京白洋)、DNA提取液(广州达安)、HTPOT40干式恒温器(合肥艾本森)、DHelix DNA扩增试剂盒(双螺旋基因)、Dhelix-C恒温扩增仪(双螺旋基因)、DYY-8C型电泳仪(北京六一)、核酸染料(上海生工)等。

1.2 LAMP引物设计

设计针对大肠埃希菌(Escherichiacoli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、和粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)等7种细菌(见表1)的特异性LAMP引物，并委托广州生工有限公司合成引物。

1.3 实验方法

1.3.1LAMP引物特异性验证 分别收集7种病原菌的1种标准菌株和5例临床菌株，提取菌株DNA，应用7组引物分别对菌种DNA进行LAMP检测。配制0.5麦氏浊度的菌悬液，取1 mL于灭菌离心管中，13 000 rpm离心15min；离心完后，弃去上清，倒入1 mL无菌生理盐水，混匀后13 000 rpm离心15 min：离心后，弃去上清，沉淀加入50 μl DNA提取液充分混匀，100 ℃保温15 min；13 000 rpm离心5 min。见表1。

表1 标准菌株编号

1.3.2回顾性实验

1.3.2.1标本收集 收集7种病原菌已发报告血培养阳性标本56例、7种病原菌以外已发报告血培养标本21例，记录报阳日期、病原菌种类等基本信息。

1.3.2.2核酸提取 用酒精灯对血培养瓶管口进行高温消毒，用5 mL注射器抽取1 mL的液体，移入1.5 mL灭菌离心管中，离心机转子半径8.3 cm，13 000 rpm离心15 min；离心完后，弃去上清，倒入1 mL无菌生理盐水，混匀后13 000 rpm离心15 min；离心后，弃去上清，沉淀加入50 μL DNA提取液充分混匀，100 ℃保温15 min；13 000 rpm离心5 min。

1.3.2.3LAMP反应 准备LAMP反应体系：按照表2所示比例在PCR管中依次加入反应试剂混匀后，加入一滴封闭液，混匀离心，盖紧管盖。在等温扩增仪上设置参数；63 ℃1 h进行扩增。标准菌株、临床菌株、七种常见病原菌血培养阳性标本用其临床鉴定结果相对应的引物检测，7种常见病原菌以外已发报告血培养标本分别用7种常见病原菌引物检测7次。见表2。

表2 LAMP反应体系

1.3.2.4检测扩增产物 采用DD染料预染色的1.0-2.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物用于确认。

1.3.3前瞻性实验

1.3.3.1标本收集 收集已报阳但未出临床鉴定结果的血培养标本34例。

1.3.3.2LAMP反应 每个标本分别用7种常见病原菌引物进行检测，反应体系及步骤同回顾性实验。

1.4 LAMP结果判断

LAMP检测阳性标本的扩增曲线呈S型曲线，检测阴性标本的扩增曲线为平缓直线；LAMP检测阳性标本的结果标识为“+”，检测阴性标本的结果标识为“-”； LAMP产物经琼脂糖凝胶电泳，检测阳性标本扩增产物呈连续荧光条带，检测阴性标本扩增产物无明显条带出现。

1.5 统计学分析

采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LAMP引物特异性验证

在7种病原菌的标准菌株和5例临床菌株中，7组引物扩增对应菌种的结果全部为阳性，扩增非对应菌种的结果全部为阴性，LAMP引物特异性为100%。

2.2 回顾性实验

2.2.1单种菌检测分析

2.2.1.1特异性和灵敏度 LAMP检测7种病原菌的特异性均为100%，其中鲍曼不动杆菌(6例)、铜绿假单胞菌(5例)、肺炎链球菌(1例)、粪肠球菌(7例)的灵敏度为100%，Youden 指数1.00，指示该方法在这四种病原菌的检测上有非常好的诊断价值。检测大肠杆菌(15例)、肺炎克雷伯菌(16例)、金黄色葡萄球菌(6例)的灵敏度分别为93%、94%、67%，Youden指数为分别0.93、0.94、0.67。见图1。

图1 单种菌检测的特异性、灵敏度和准确度(%)

2.2.1.2准确度和一致性 LAMP检测鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、粪肠球菌的准确度为100%，Kappa值=1.00>0.75，检测大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的准确度为94.44%和94.74%，Kappa值分别为0.824和0.826，结果均大于0.75，表明两种方法有极好的一致性。检测金黄色葡萄球菌的准确度为77.78%，Kappa值=0.571，0.40

2.2.1.3χ2检验 对实验结果进行χ2检验后得出，大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、粪肠球菌这六种菌的P值=1.00，金黄色葡萄球菌的P=0.50,均大于0.05，LAMP和全自动细菌鉴定仪方法检测的差异无统计学意义。

2.2.2整体检测分析 LAMP检测7种菌的灵敏度为0.93、特异性为1.00，Youden指数为0.93。该检测方法的准确度为94.80%，与全自动细菌鉴定仪方法的Kappa值=0.876>0.75，两种方法有很好的一致性。卡方检验后得出P=0.125>0.05，两种方法的差异无统计学意义。

2.3 前瞻性实验

LAMP检测7种菌的灵敏度为0.83、特异性为1.00，Youden指数为0.83。该检测方法的准确度为88.23%，与全自动细菌鉴定仪方法的Kappa值=0.755>0.75，表明两种方法有较好的一致性。卡方检验后得出P=0.125>0.05，两种方法的差异无统计学意义。

3 讨论

引物特异性验证试验结果显示，LAMP检测7种病原菌的特异性达100%，无非特异性结果出现，表明引物设计合理。回顾性实验结果显示，LAMP检测鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎链球菌、粪肠球菌的灵敏度和准确度均为100%，该技术在这四种菌的检测上有很好的临床价值，且kappa值均大于0.75，与传统检测方法有非常好的一致性。对于大肠杆菌、肺炎克雷伯菌，其灵敏度为93%和94%，准确度为94.44%和94.74%，两种菌的LAMP检测在统计学上与传统鉴定方法有很好的一致性。回顾性实验的整体检测分析表明该技术的灵敏度达93%，特异性为100%，准确度为94.80%，与传统方法有很好的一致性，LAMP检测单种菌和7种菌与传统方法均无统计学差异。前瞻性实验的灵敏度为83%、特异度为100%，准确度为88.23%，与传统方法有较好的一致性，且无统计学差异。此外，LAMP方法能检测混合感染，优于其他阳性血培养物鉴定方法。

我们应用的LAMP方法也存在不足之处。实验中共有5例金黄色葡萄球菌未检测出，其原因可能是该菌具有很厚的细胞壁，实验中使用的热裂解法无法有效地裂解细菌；另外大部分临床菌株还分泌耐热核酸酶，该酶在高温下不会失活，会降解细菌裂解所释放的核酸，导致LAMP检测出现假阴性结果[14]。实验中2例肺炎链球菌标本均检测出，但是我们发现只对需氧瓶进行检测存在漏检风险。由于厌氧瓶中的还原物质可中和细菌产生的过氧化物酶和超氧化物酶，肺炎链球菌在厌氧瓶中的存活时间相比需氧瓶更长，采取需氧、厌氧瓶同时检测有助于预防漏检。另外，肺炎链球菌会产生自溶酶，随着培养时间的延长，细菌溶解会导致检测呈假阴性，所以需要及时检测[15]。LAMP实验假阴性结果产生的原因还包括基因突变、血培养瓶内其它物质如活性炭的影响等，我们将在后续的实验中针对上述因素做进一步分析。

综上所述，尽管传统的血培养阳性瓶转种鉴定方法准确性高，而且方便进行后续的药敏实验，但是存在着检测时间长、操作繁琐等缺点。临床上根据血培养结果执行的三级报告制度中，一、二级报告对血液感染患者的诊断治疗也具有很好的指导价值[16-18]。因此，为了快速准确地鉴定血流感染病原菌并完成二级报告，已应用核酸扩增方法(如PCR、二代测序技术等)、非核酸扩增方法(如荧光原位杂交法、微阵列基因芯片分析技术、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱等)等方法来检测血培养标本，但这些技术存在着技术要求高、无法检测混合感染和准确度不高等缺点[19-22]。近年来，LAMP技术也逐渐被应用于血液感染病原菌的检测，如大肠杆菌[23]、金黄色葡萄球菌[24]等，鉴于其简便快速、高灵敏度、高特异性等特点，该技术在血液感染的诊断中将拥有广阔的应用前景[25-26]。