长春西汀注射液中2种磺酸酯类基因毒性杂质的测定*

焦 洁，妙 苗，王 涛，蔡 虎

（陕西省食品药品监督检验研究院·国家药品监督管理局药品微生物检测技术重点实验室，陕西 西安 710065）

长春西汀注射液是由主药长春西汀和辅料山梨醇、苯甲醇等经现代工艺精制而成的无菌注射液，临床主要用于改善脑梗死后遗症、脑出血后遗症、脑动脉硬化症等诱发的各种症状［1］。其主药以长春胺为起始原料，经脱水消除、水解和酯化制得。在长春西汀中间体制备过程中使用了对甲苯磺酸作催化剂，后续处理过程中虽进行了充分洗涤，但仍可能存在对甲苯磺酸残留，在后续的酯化反应中会继续反应，生成基因毒性杂质对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯，故需在成品的质量控制中严格控制后两者含量。目前，对甲苯磺酸酯类的检测方法主要有高效液相色谱（HPLC）法［2-8］、液质联用法［9-12］、气质联用法［13-15］等。HPLC法具有成本低、分离快、灵敏度高、适用于热不稳定化合物等优点。本研究中建立了测定长春西汀注射液中对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯含量的HPLC法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

e2695型高效液相色谱仪，含2998二极管阵列检测器（美国Waters公司）；XPE-105型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；KQ2200E型超声波清洗器（昆山市超声波仪器有限公司）。

1.2 试药

对甲苯磺酸甲酯对照品（批号为F1012054，含量为98.0%），对甲苯磺酸乙酯对照品（批号为E1012037，含量为98.0%），均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；长春西汀注射液（7个厂家，共79批，包括2mL∶10mg，5 mL∶30 mg，2 mL∶20 mg 3种规格）；磷酸为分析纯，乙腈为色谱纯，水为高纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：WatersODS2C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（39∶61，V／V）；流速：1.0mL／min；检测波长：226nm；柱温：35℃；进样量：20μL。

2.2 溶液制备

混合对照品溶液：取对甲苯磺酸甲酯对照品和对甲苯磺酸乙酯对照品各适量，精密称定，用流动相溶解，并制成两者质量浓度均约为0.25μg／mL的混合对照品溶液。

供试品溶液：取2 mL∶20 mg规格样品3支，混匀，精密量取5 mL，置10 mL容量瓶中，用流动相稀释并定容，摇匀，即得；其余规格样品，直接取样品溶液进样。

阴性对照品溶液：根据各厂家提供的长春西汀注射液处方，取山梨醇、苯甲醇、维生素C、焦亚硫酸钠、酒石酸等辅料适量，用流动相溶解并滤过，取滤液，即得。

空白溶液：取流动相，作为空白溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2项下除供试品溶液外的3种溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，理论板数以对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯峰计分别为13 359和13 880，分离度为9.2，空白溶液和阴性对照品溶液对测定无干扰。详见图1。

图1 专属性试验高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of the specific test

线性关系考察：取对甲苯磺酸甲酯12.24 mg和对甲苯磺酸乙酯9.27 mg，精密称定，置同一100 mL容量瓶中，用流动相溶解，并定容，摇匀。精密量取2.5 mL，置100 mL容量瓶中，用流动相溶解并定容，摇匀，作为线性试验混合对照品贮备液。精密量取1，1.5，2，3，4 mL，分别置20 mL容量瓶中，用流动相定容，摇匀，即得线性混合对照品溶液。精密量取20μL，按2.1项下色谱条件进样测定，得回归方程，对甲苯磺酸甲酯为Y1＝63 593.589 2X1-309.226 0（r1＝0.999 9，n＝5），对甲苯磺酸乙酯为Y2＝61 195.719 7 X2-317.174 5（r2＝0.999 8，n＝5）。结果表明，对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯质量浓度分别在0.149 9～0.599 8μg／mL和0.1136～0.4542μg／mL范围内与峰面积线性关系良好。

回收率试验和加标重复性试验：考虑到各厂家间工艺、处方的差异，取长春西汀注射液使用辅料最多的G公司生产批号为1901261的样品10支（规格为2 mL∶20 mg，均未检出对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯），混匀，精密量取2 mL，共6份，分别精密加入一定量的对照品溶液2 mL，摇匀。精密量取20μL，按2.1项下色谱条件进样测定，按外标法计算回收率。结果见表1。根据2015年版《中国药典（四部）》通则0901分析方法验证指导原则中回收率相关要求，待测成分含量在0.1%时，回收率限度为90%～108%。本方法试验中对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的回收率分别为98.78%和99.33%，表明准确度符合要求。6份加标样品中对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯含量的RSD均小于3.0%，表明方法的重复性符合要求。

表1 回收率试验结果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n＝6）

定量限和检测限确定：取线性混合对照品溶液，逐级稀释，按2.1项下色谱条件进样分析，得对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的定量限（信噪比＞10时）分别为0.037μg／mL和0.045μg／mL，检测限（信噪比＞3时）分别为0.015μg／mL和0.023μg／mL。

精密度试验：精密量取2.2项下混合对照品溶液20μL，连续进样测定6次。结果对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯峰面积的RSD分别为0.92%和1.96%（n＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液，于室温放置0，1，2，3，4，5，6，7，8h时分别按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果显示，对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯峰面积有变小的趋势，RSD分别为4.00%和4.20%（n＝9），建议供试品溶液在配制后6h内测定（此时的RSD均小于2.0%）。

2.4 样品测定

分别取7个厂家各1批样品（A公司，批号为191108；B公司，批号为P1／20190901；C公司，批号为A92055A；D公司，批号为11904042；E公司，批号为1902211；F公司，批号为1906181；G公司，批号为1901241），按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，色谱图见图2。按外标法计算，结果均未检出对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯。

3 讨论

3.1 流动相优化

图2 7批样品高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of seven batches of samples

预试验中先后考察了3种流动相：①乙腈-0.1%磷酸溶液（39∶61，V／V），检测波长为226 nm；②乙腈-水（40∶60，V／V），检测波长为220 nm；③乙腈-0.2 mol／L醋酸铵溶液（50∶50，V／V），检测波长为260 nm。结果发现，3种流动相均可满足系统适用性试验要求，但流动相③的检测限比流动相①和流动相②约高10倍，流动相②的系统耐用性较差，故选择流动相①。

3.2 色谱柱选择

预试验中先后考察了3种色谱柱：①Waters ODS2 C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；②Agilent TC-C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；③ACEExcel C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。结果发现，采用乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相时，3种色谱柱均可满足系统适用性试验要求，但选择色谱柱②和色谱柱③时，2种待测物出峰时间均晚于长春西汀主成分，由于供试品溶液浓度较大，有拖尾现象，导致2种待测组分的灵敏度低，达不到限度要求。选择色谱柱①时，2个待测组分在长春西汀主峰前流出，可杜绝高浓度样品对待测组分的干扰，降低基线噪音，提高检测的灵敏度。故选择色谱柱①。

3.3 待测物确认

试验过程中发现，供试品溶液色谱图中，在待测物保留时间附近还有其他色谱峰，为排除因保留时间漂移引起的漏检，对上述样品均进行加标回收验证，试验结果表明，该色谱峰不是待测物，应为长春西汀原料引入的其他杂质。

3.4 限度确定

根据人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）的规定，基因毒性杂质的最大摄取量为1.5μg／d［16-17］，长春西汀每天最大用量为30 mg，按此计算，确定对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的限度不得超过0.005%。

3.5 方法评价

本研究中建立的HPLC法可快速、准确地对注射用长春西汀中对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯进行定性及定量分析，避免使用液质仪、气质仪等贵重和普及度较低的仪器，降低了检验成本，提高了方法的可行性，可为该药中潜在的有害杂质的检测提供参考。