七彩神仙鱼OTX2基因克隆及其表达分析

魏域玲，温 彬，高建忠，陈再忠

(1.上海海洋大学国家水产科学实验教育示范中心，上海 201306； 2.上海海洋大学农业与农村部淡水水生遗传资源重点实验室，上海 201306； 3.上海水生动物遗传育种协同创新，上海海洋大学，上海 201306； 4.上海海洋大学上海市水产养殖工程研究中心，上海 201306)

七彩神仙鱼(Symphysodonharaldi)[1]隶属于鲈形目(Perciformes)慈鲷科(Cichlidae)，原产于亚马逊河流域，经人工驯养和繁殖成为最具观赏价值的热带观赏鱼之一[2]。七彩神仙鱼幼鱼会啄食亲鱼体表的粘液[3，4]，这种特殊的行为与哺乳动物的哺育行为非常相似。

同源异形框基因2(orthodenticle homeobox 2，otx2)[5,6]属otx家族[7]，其编码的蛋白质作为转录因子，在脑[8]、颅面和感觉器官发育中都发挥重要的作用[7，9-10]。同时，otx2还是影响多巴胺神经元产生的一个关键基因[8]，能够调节中脑基底盘的神经元产生的活性和多巴胺前体细胞的增殖及分化[11]。而多巴胺在哺乳动物中枢神经系统中有着极其重要的生理功能，包括运动的整合、认知、情感、奖赏、意识和记忆[11，12]。

本研究对七彩神仙鱼otx2基因全长进行克隆，验证并分析了该基因在不同组织中的表达，并在七彩神仙鱼脑组织中对该基因进行定位，旨在预测otx2基因在七彩神仙鱼亲代抚育过程中可能起到的作用，为了解七彩神仙鱼亲代抚育提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用鱼取自上海海洋大学滨海基地，选取六尾雌性七彩神仙鱼亲鱼，分别取脑、肌肉、性腺、皮肤、肝脏、心脏、肠道和肾脏组织，迅速置于液氮，-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取与cDNA的合成

采用Trizol(Invitrogen 公司)试剂盒，根据试剂盒说明提取七彩神仙鱼各组织RNA，其质量检测方法参照实验室已有技术[2]。以提取的RNA为模板，按照PrimeScriptTMRT kit试剂盒(TaKaRa，上海生工生物公司)说明书合成cDNA于-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物合成

从本实验室测定脑组织转录组数据库中选取otx2片段设计引物Otx2-F-Primer和Otx2-R-Primer(表1)，用于七彩神仙鱼otx2基因扩增。根据克隆验证得到的otx2基因序列设计荧光定量 PCR 特异性引物Otx2-qPCR-F 和Otx2-qPCR-R；采用本实验室之前所用的七彩神仙鱼内参基因β-actin 设计基因引物β-actin-qPCR-F和β-actin-qPCR-R，上述引物均采用 Primer 5.0 设计，由上海生工生物技术有限公司合成。

表1 七彩神仙鱼otx2基因克隆及荧光定量PCR引物Tab.1 Cloning and fluorescence quantitative primers of otx2 gene in S.haraldi

1.2.3Otx2基因的克隆

以七彩神仙鱼脑组织的cDNA为起始模板，加入2.5 mmol/L dNTP Mixture，4 μL；10×PCR buffer，5 μL；Otx2-F-Primer和Otx2-R-Primer各2 μL；TaKaRa Taq TM(5 U/μL)，0.5 μL；cDNA，3 μL；ddH2O补齐至 50 μL。反应程序为 94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延申1 min，循环35次，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃终止程序。PCR 反应结束后，在1%的琼脂糖凝胶电泳中以D2000 DNA Marker作为分子质量标准进行检测,并置于紫外凝胶成像系统中观察电泳结果，产物回收送上海生工测序。

1.2.4Otx2基因的生物信息学分析

采用 DNAMAN 软件将测序所得cDNA序列进行拼接，运用BLAST查询该物种在数据库中同其他物种的otx2基因序列同源性相似程度；使用生物信息学网络平台NCBI上的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具分析七彩神仙鱼otx2基因序列的开放阅读框，进一步推导出该基因的氨基酸序列；使用NCBI的CD Search程序搜索该基因的蛋白功能结构域；采用SMART 分析蛋白质保守结构域；运用Phyre2预测otx2蛋白质三级结构；采用DNAMAN软件进行氨基酸序列多重对比；最后使用Clustal X和MEGA 7软件基于Neighbor Joining邻接法对其构建系统发育树。

1.2.5 七彩神仙鱼otx2基因的表达分析

采用相对定量的方法对七彩神仙鱼otx2基因在不同组织的表达量进行测定。以各个组织的总RNA反转录产物为起始模板，选择内参β-actin 基因，目标基因otx2，分别对所选不同组织进行实时荧光定量 PCR 反应，每个样品重复测定 3 次。实验室采用BIO-RAD CFX 96定量PCR仪，SYBR Green I荧光染料。以 20 μL为反应体系，其中2×SuperReal PreMix Plus(TianGen)10 μL，正反向引物各 0.6 μL，cDNA 模板为 1 μL，最后补齐RNase Free dH2O 7.8 μL。反应程序：95 ℃ 5 min，1个循环；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，39个循环；95 ℃ 30 s，1个循环。根据otx2基因和 β-actin 基因在各组织中扩增得到的Ct值，通过 2-ΔCt法计算七彩神仙鱼各组织中otx2基因的相对表达量。采用Graphpad 7.0 进行组织表达谱分析。

1.2.6 石蜡切片的制作和原位杂交实验

脑组织取出洗净后立即放入4%多聚甲醛固定液(DEPC水配制)中固定2～12 h。之后经梯度酒精脱水后浸蜡、包埋和切片。再根据脑组织固定时间长短，切片在修复液中煮沸10～15 min，自然冷却。后用基因笔画圈，滴加蛋白酶K(20 μg/mL)37 ℃消化30 min，用纯水冲洗后PBS洗3次×5 min。然后滴加预杂交液，37 ℃孵育1 h。之后倾去预杂交液，滴加含探针杂交液(探针合成序列为：5-CY3-AGUAGUCCUUUCUCGCCUCUGCUUCCGUG 3,由上海生工生物工程股份有限公司合成探针杂交液)，浓度5 ng/μL，恒温箱37 ℃杂交12 h，洗去杂交液(2X SSC，37 ℃ 洗10 min，1X SSC，37 ℃洗2×5 min，0.5X SSC室温洗10 min)。之后用DAPI复染核[切片滴加DAPI染液(2 μg/mL)避光孵育8 min]，冲洗后滴加抗荧光淬灭封片剂封片。最后镜检拍照(切片正置于荧光显微镜下观察并采集图像)。

2 结果与分析

2.1 七彩神仙鱼otx2基因克隆和序列分析

结果显示otx2基因的cDNA序列CDS区序列长度为873 bp(图1),包括290个氨基酸序列编码的873 bp完整的开放阅读框(图2)。对开放阅读框进行生物信息学分析，得到otx2基因的蛋白分子质量为31 771.55 Da，理论等电点为 9.40。用Phyre2预测了七彩神仙鱼otx2基因蛋白三级结构，发现了otx2基因的结构域空间位置在第42～94个氨基酸之间，另一个是在第154～235个氨基酸之间(图3)。

2.2 Otx2基因的同源比较和进化分析

图1 七彩神仙鱼otx2基因 PCR 扩增结果Fig.1 The PCR amplification results of otx2 gene of S.haraldi 1:七彩神仙鱼扩增结果；marker：DNA marker

图2 七彩神仙鱼otx2基因的cDNA序列和推测的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and the predicted amino acid sequence of otx2 gene in S.haraldi ATG为翻译起始子，*为翻译结束终止子，红线标记为氨基酸的结构域

图3 Phyre2软件预测七彩神仙鱼蛋白结构Fig.3 Phyre2 software predicts the protein structure of S.haraldi NT:氨基端；CT：c端 ；红色:α螺旋

图4 七彩神仙鱼与其他物种otx2基因的氨基酸序列比对分析Fig.4 Multiple sequence alignment analysis of amino acid sequences of otx2 gene in S.haraldi

2.3 不同组织中otx2基因的表达分析

通过q-PCR方法检测七彩神仙鱼otx2基因在不同组织中的表达水平，otx2基因在脑组织中表达量较高，其它组织中的表达量较少，其中在心脏组织中表达量高于性腺、肠道、肾脏、肝脏、肌肉和皮肤组织(图6)。因此otx2基因在七彩神仙鱼不同组织中的表达水平情况存在差异性。

2.4 Otx2基因的原位杂交结果

七彩神仙鱼成熟雌性脑组织横切面的原位杂交结果显示otx2探针在七彩神仙鱼中脑的小球周灰质带、纵枕、顶盖室等区域均有表达(图7)。

图5 基于不同物种的otx2氨基酸序列构建的邻接系统发育树Fig.5 Phylogenetic trees of different species on amino acid sequence of otx2 using neighbor joining method

图6 七彩神仙鱼不同组织otx2基因荧光定量分析Fig.6 Fluorescence quantitative analysis of otx2 gene of S.haraldi in different tissues

图7 otx2在七彩神仙鱼脑组织荧光原位杂交Fig.7 Fluorescence in Situ hybridization of otx2 in the brain of S.haraldi TI:纵枕；PGZ:小球周灰质带；TeV:顶盖室

3 讨论

本研究从七彩神仙鱼脑组织中克隆了otx2基因，蛋白分析软件Phyre2构建了七彩神仙鱼的蛋白结构预测图及其结构域。同时，氨基酸同源性分析结果表明七彩神仙鱼与大多数鱼类的otx2类似具有较高的保守性。另外，七彩神仙鱼与尼罗罗非鱼的otx2氨基酸序列具有较高的相似性，而七彩神仙鱼和尼罗罗非鱼又均属于慈鲷科[13]，因此这一结果验证了克隆得到的otx2基因序列的可靠性，对于该基因在调节七彩神仙鱼特殊的行为的基因功能预测中起到促进作用。

荧光定量PCR结果显示，otx2基因在七彩神仙鱼各组织中的表达量存在差异。otx2基因在七彩神仙鱼大脑组织中的表达量与其他组织的表达量相比较是最高，这与牙鲆(Paralichthysolivaceus)[5]、斑马鱼(Brachydaniorerio)[14]、人类(homosapiens)[15]中的实验结果相似。在大脑、颅面和感觉器官发育中都发挥着非常重要的作用[7，9-10]。有研究发现otx2基因在神经系统模式形成、细胞命运规范和分化中发挥关键作用[15]。

通过原位杂交，我们在七彩神仙鱼中脑的小球周灰质带、纵枕、顶盖室发现otx2基因。众所周知中脑与情绪活动有关[16]，中脑顶盖接受多方面的神经纤维[17]，它不仅是视、听反射的中枢，还可能是触觉、温度觉、痛觉的整合中枢[17,18]。由此可以推测七彩神仙鱼被幼鱼啄食时可能会发生触觉、痛觉等。不仅如此，多巴胺还与牛奶的分泌有关[19]。七彩神仙鱼这种用粘液喂食幼鱼的行为可能与哺乳动物的哺育行为相似，它皮肤表皮分泌的粘液可能与哺乳动物分泌的牛奶[20]类似。因此otx2基因在七彩神仙鱼亲代抚育时在中脑中发挥的作用更加值得我们去探究。

4 结论

本试验通过克隆得到七彩神仙鱼雌性otx2基因，并对该基因进行生物信息学分析，该基因具有典型的otx保守结构域。运用实时荧光定量 PCR 对otx2基因在雌性七彩神仙鱼各组织中的表达差异进行了分析，得到otx2基因在中脑中高表达，并且在其他组织中也有表达。同时通过原位杂交技术得到otx2基因在雌性七彩神仙鱼中脑的小球周灰质带、纵枕、顶盖室均有表达。本研究为探讨otx2基因在雌性七彩神仙鱼亲代抚育调控机制奠定了基础。