11份草地早熟禾种质材料对PEG-6000胁迫的生理响应和耐旱性评价

张然，李佳缙，王铭，吉凌鹤，侯瑄，马祥，马晖玲

(1.甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070；2.青海省畜牧兽医科学院青藏高原优良牧草种植资源利用重点实验室，青海 西宁 810016)

草地早熟禾(Poapratensis)作为禾本科早熟禾属多年生草本植物，是世界上种植最广泛的冷型草坪草之一[1]。因其耐践踏、耐修剪和再生能力强而广泛用于公园、高尔夫球场、城市景观和其他运动场草坪[2]。近年来，由于全球气候暖化、极端气温频发、工业和农业迅猛发展，加剧了水资源的不确定性和极端干旱的发生[3]。干旱是限制世界各地草坪草生长的主要非生物因素之一[5]。研究表明，当草坪草所处环境的干旱程度低于其最高耐受阈值时，草坪草通过调节自身的生理生化特性来适应环境条件的改变。然而，当草坪草生长环境的干旱程度高于其最高耐受阈值时，会引起草坪草细胞、组织和器官永久损伤，进而影响草坪草的生长和发育，甚至导致植株死亡[6]。干旱胁迫对草坪草的伤害程度取决于胁迫时间、草坪草的发育阶段和基因型[7]。草地早熟禾喜光、耐阴、耐旱，但苗期耐旱性相对较弱[8]，因此选育具有优良遗传性状的草地早熟禾种质对草坪的建植至关重要。

我国是世界上早熟禾资源最丰富的国家之一，国家牧草种质资源中心库保存着71个早熟禾属、148种草地早熟禾种质材料[9]。野生早熟禾具有较强的抗逆性。王婧等[10]应用NaCl处理14种草地早熟禾，发现‘蓝天鹅’‘优异白’‘蓝狐’‘肯塔基’和‘优美’品种耐盐性较好。白小明等[11]利用NaCl和Na2SO4处理8个甘肃野生早熟禾种质材料种子，发现萌发期小药早熟禾耐盐性较好。鲜靖苹等[12]比较了10种草地早熟禾的耐镉性，结果表明‘午夜’品种具有良好的耐镉性。吕优伟等[13]对甘肃境内9个野生早熟禾材料进行低温处理，发现一年生早熟禾耐寒性较强。田莉华等[14]选取青海省海北地区的8种早熟禾属种质材料进行耐旱评价，发现草地早熟禾、高原早熟禾和山地早熟禾的耐旱性较好。

甘肃省和青海省地形复杂，气候多变，横跨湿润、半湿润、半干旱和干旱区，早熟禾属资源丰富[15]。因此，本试验选取3个甘肃野生草地早熟禾材料，4个青海野生草地早熟禾材料和4种草地早熟禾商用品种开展苗期干旱胁迫试验，通过测定其生理指标的变化并用隶属函数对苗期的耐旱性进行评价，阐明11种草坪草耐旱性强弱，以期为甘肃省和青海省草地早熟禾耐旱品种的选择和培育提供理论参考依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料(表1)由甘肃农业大学草业学院和青海省畜牧兽医科学院提供，分析纯PEG-6000购自上海源叶生物科技有限公司。

表1 供试草地早熟禾种质材料及其来源

1.2 试验设计

挑选籽粒饱满、大小均一的草地早熟禾种子，用无菌水过夜浸泡，70%的酒精处理1 min，无菌水冲洗3～5次，20%(V/V)的次氯酸钠消毒30 min，无菌水冲洗5～6次，最后用滤纸将水吸干备用。试验所用种植土为消毒后的蛭石和营养土(重量比3:1)，每个育苗钵装入0.5 kg，将处理后的种子于2019年9月15日种植于育苗钵内，放置在19楼培养室，设置昼/夜温度为25℃/20℃，每天光周期循环14 h，相对湿度为65%。每天18∶00～20∶00 及时补充水分，采用称重法控制土壤含水量，正常灌溉保持土壤含水量在20%～23%(由预实验所得的草地早熟禾盆栽土壤饱和含水量)。待95%种子长出第1片真叶时将育苗钵转移到含1/2 Hoagland营养液的培养盒中，每4 d更换1次培养盒的营养液。待幼苗长至4～5片真叶时进行干旱胁迫处理，处理组将培养盒的溶液换成含15% PEG-6000的1/2 Hoagland营养液，对照组(CK)为1/2 Hoagland营养液，每隔3 d更换1次营养液，每组处理3次重复。处理第12 d采样测定其抗性指标。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 相对含水量的测定[18]取处理12 d后的地上部幼苗叶片，迅速称量鲜重(FW)；将叶片用去离子水浸泡24 h(此过程需遮光)；取出后用吸水纸吸干叶片表面的水分，迅速称量叶片饱和重量(TW)；将叶片放入105℃烘箱杀青30 min，然后在80℃烘干至恒重，称量干重(DW)，计算相对含水量(RWC)：

RWC (%)=[(FW-DW)/(TW-DW)]×100%

1.3.2 膜质过氧化物测定 丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)显色法测定[19]；

1.3.3 渗透调节物质含量的测定 游离脯氨酸(Pro)含量采用茚三酮显色法测定[20]；可溶性糖含量(soluble sugar,SS)采用蒽酮比色法测定[19]；

1.3.4 叶绿素含量的测定 叶绿素(Chl)含量采用乙醇提取法测定[20]，按照公式计算叶绿素含量：

Ca=13.95D665 nm-6.88D649 nm；Cb=24.96D649 nm-7.32D665；C叶绿素=Ca+ Cb；叶绿素含量=C叶绿素×V/W；

式中，Ca：叶绿素a浓度；Cb：叶绿素b浓度；C叶绿素：叶绿素浓度；V：提取液体积(L) ；W：称取样品质量(g)。

1.3.5 抗氧化酶活性的测定 超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑显色法测定[19]；过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外比色法测定[19]；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定[19]。

1.4 数据分析

采用SPSS 24.0进行数据分析，用平均值和标准误表示测定结果，对同种材料间对照组和处理组各指标采用t检验，对各指标相对含量进行单因素方差分析(P<0.05)，用Duncan法对各数据进行多重比较；采用GraphPad Prism 8作图。

相对增加量(%)=[(处理组-对照组)/对照组]×100%(包括SOD、POD、CAT活性，Pro、MDA、可溶性糖含量)；

相对减少量(%)=[(对照组-处理组)/对照组]×100%(包括相对含水量、叶绿素含量)；

应用模糊数学中隶属函数值法，就各指标的相对含量进行综合分析。隶属函数公式为：

当指标性状与缓解干旱胁迫呈正相关时，公式为：U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)；

当指标性状与缓解干旱胁迫呈负相关时，公式为：U(Xi)=1-[(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)]。

其中，U(Xi)表示隶属函数值；Xi表示处理水平某指标的测定值；Xmin和Xmax表示参试水平系中某一指标内的最小值和最大值。最后将各个指标的隶属函数值进行累加，求平均值，进行排序。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对草地早熟禾幼苗叶片相对含水量的影响

干旱胁迫下11个草地早熟禾种质材料幼苗叶片RWC均有不同程度的降低。M3、M8、M10、M11与对照差异极显著(P<0.01)，M1、M2、M5、M6、M7、M9相比于对照差异显著(P<0.05)，M4较对照无差异(图1-A)。M2、M3、M11的叶片相对含水量分别较对照降低了30.71%、32.89%、30.49%，显著高于其他材料(P<0.05)；M4、M5、M8、M10的相对含水量降低值较小，分别为13.41%、13.98%、14.99%、13.31%，但与M6，M7和M9差异不显著(P>0.05)，与其他材料相比差异显著(P<0.05)(图1-B)。M4、M5、M8、M10经过干旱胁迫后，幼苗叶片RWC降低幅度较小，而M2、M3、M11的RWC降低幅度较大。

图1 草地早熟禾幼苗叶片相对含水量和相对减少量Fig.1 Relative water content and relative water content reduction of leaves of Kentucky bluegrassseedlings注：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)，ns表示差异不显著，不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同

2.2 干旱胁迫对草地早熟禾幼苗叶片丙二醛含量的影响

11种材料经15%PEG-6000处理后，MDA含量均有增加，其中M1、M3、M6、M11较对照差异极显著(P<0.01)，M4、M7、M8、M10较对照差异显著(P<0.05)，M2、M5、M9与对照相比无显著差异(图2-A)。M6和M11 MDA含量相对增加量显著高于其他材料(P<0.05)，分别为153.21%、148.29%；而M2和M8较对照分别降低了13.59%和9.73%，显著低于其他材料(P<0.05)。这说明11个草地早熟禾材料叶片的MDA含量均受干旱胁迫的影响，M6和M11的MDA含量变化较大，叶片膜脂过氧化程度较高，M2和M8的MDA含量变化较小，叶片细胞膜系统受损程度较轻(图2-B)。

图2 草地早熟禾幼苗叶片丙二醛含量和相对增加量Fig.2 MDA content and relative added value of MDA content of leaves of Kentucky bluegrass seedlings

2.3 干旱胁迫对草地早熟禾幼苗叶片渗透调节物质含量的影响

2.3.1 干旱胁迫对草地早熟禾幼苗叶片脯氨酸含量的影响 经干旱胁迫后，M5的Pro含量与对照相比差异不显著，其余10种草地早熟禾材料叶片Pro含量较对照均显著增加(P<0.01)(图3-A)。Pro含量相对增加量，M1显著高于其他材料(P<0.05)，相比于对照增加了207.10%；M8和M10的Pro含量相对增加量分别较对照增加176.12%、157.41%，低于M1，但显著高于其他材料(P<0.05)；而M5和M11的Pro含量相对增加量分别为16.06%、19.83%，显著低于其他材料(P<0.05)(图3-B)。这说明干旱胁迫下M1、M8和M10产生Pro，可降低细胞内水势，提高细胞渗透调节能力，而M5和M11产生Pro较少，对细胞渗透调节能力相对较弱。

图3 草地早熟禾幼苗叶片脯氨酸含量和相对增加量Fig.3 Pro content and relative added value of Pro content of leaves of Kentucky bluegrassseedlings

2.3.2 干旱胁迫对草地早熟禾幼苗叶片可溶性糖含量的影响 干旱胁迫下，11种材料的可溶性糖含量均呈极显著增加(P<0.01)(图4-A)。其中M6和M10的SS含量相对增加量分别为329.14%和328.77%，显著高于其他材料(P<0.05)，而M2和M7的SS含量相对增加量显著低于其他材料(P<0.05)，分别为38.09%和25.12%(图4-B)。这表明11种草地早熟禾材料幼苗都会通过积累可溶性糖来响应干旱胁迫，M6和M10积累较高的可溶性糖来提高草地早熟禾的渗透调节能力，而M2和M7积累可溶性糖含量相对较低更容易受到干旱胁迫的影响。

图4 草地早熟禾幼苗叶片可溶性糖含量和相对增加量Fig.4 Soluble sugar content and relative added value of soluble sugar content of leaves of Kentucky bluegrass seedlings

2.4 干旱胁迫对草地早熟禾幼苗叶片叶绿素含量的影响

11种草地早熟禾材料幼苗叶片Chl含量均有不同程度的下降(图5-A)。其中M1和M11下降幅度最大，显著高于其他材料(P<0.05)，分别为86.02%和85.33%；而M5、M8、M9和M10的相对Chl含量降低量最小，显著低于其他材料(P<0.05)，分别为19.61%、24.65%、21.85%和21.71%(图5-B)。这表明M5、M8、M9和M10的Chl含量受干旱胁迫影响较小，而M1和M11受干旱胁迫影响较大。

图5 草地早熟禾幼苗叶片叶绿素含量和相对降低量Fig.5 Chlorophyll content reduction of leaves of Kentucky bluegrass seedlings

2.5 干旱胁迫对草地早熟禾幼苗叶片抗氧化酶活性的影响

2.5.1 干旱胁迫对草地早熟禾幼苗叶片SOD活性的影响 干旱胁迫下，11种草地早熟禾材料幼苗SOD活性较对照均有提高，其中M2、M3、M4和M10与对照相比差异极显著(P<0.01)；M7、M8、M9和M11与对照相比差异显著(P<0.05)；而M1、M5和M6与对照相比无显著差异(图6-A)。SOD活性相对增加量，M10最大，较对照增加了61.41%，显著高于其他材料(P<0.05)，M1和M11的SOD活性相对增加量显著低于其他材料，分别为3.11%和4.62%(图6-B)。

图6 草地早熟禾幼苗叶片SOD 活性和相对增加量Fig.6 SODactivity and relative added value of SOD activity of leaves of Kentucky bluegrass seedlings

2.5.2 干旱胁迫对草地早熟禾幼苗叶片POD活性的影响 干旱胁迫下，11种草地早熟禾材料幼苗POD 活性均有不同程度的提高。其中M1、M2、M6、M7、M8、M10和M11较对照差异极显著(P<0.01)；M3和M4与对照相比差异显著(P<0.05)；而M5和M9和对照相比无显著差异(图7-A)。POD 活性相对增加量M2和M10分别为83.36%和90.87%，增加幅度大于其他区材料；而M1和M11的增加幅度较小，仅为8.93%和7.90%，显著低于其他材料(P<0.05)(图7-B)，这表明干旱胁迫M1和M11的POD活性受胁迫影响较大。

图7 草地早熟禾幼苗叶片POD 活性和相对增加量Fig.7 POD activity and relative added value of POD activity of leaves of Kentucky bluegrass seedlings

2.5.3 干旱胁迫对草地早熟禾幼苗叶片CAT活性的影响 干旱胁迫下，11种草地早熟禾材料幼苗叶片中CAT活性明显提高，M5、M8、M9和M10较对照差异极显著(P<0.01)；M1、M2、M3和M6较对照差异显著(P<0.05)；材料M4、M7和M11较对照无显著差异(图8-A)。11种材料，M10的CAT活性相对增加量为78.71%，显著高于其他材料(P<0.05)；M7和M11的增加幅度较小，低于其他材料，仅为7.66%和8.16%(图8-B)，这表明M10幼苗CAT活性受干旱胁迫影响较低，而M7和M11受胁迫影响较大。

图8 草地早熟禾幼苗叶片CAT活性和相对增加量Fig.8 CAT activity and relative added value of CAT activity of leaves of Kentucky bluegrass seedlings

2.6 干旱胁迫对草地早熟禾幼苗叶片各指标的综合评价

以RWC、Chl、Pro、SS、MDA含量、SOD、CAT、POD活性8个抗旱性相关指标的相对增加量为依据，计算各个指标的平均隶属函数值，对11种草地早熟禾苗期耐旱性进行综合评价，M11隶属平均值最小(0.09)，耐旱性最弱；而M10的平均值最大(0.90)，耐旱性最强；11种草地早熟禾种质材料耐旱性强弱依次为M10>M8>M9>M2>M5>M4>M3>M6>M7>M1>M11(表2)。

表2 干旱胁迫对草地早熟禾幼苗叶片各指标隶属函数值及耐旱性排序

3 讨论

草坪草体内正常的水分含量对维持其细胞功能至关重要，水分吸收取决于根系的特性和功能，水分的消耗和保持主要受地上部生长和生理活动的控制[21]。叶片相对含水量是衡量植物组织水分状况及吸水和失水动态平衡的重要指标，在一定程度上能体现出植物对干旱胁迫的耐受能力。相对含水量下降速度慢，幅度小，则抗旱性强，反之则弱[22]。本研究通过模拟干旱胁迫，对11种不同生境幼苗期草地早熟禾的耐旱性进行评价，结果表明，干旱胁迫导致11种草地早熟禾幼苗相对含水量均有不同程度的下降，这与细叶芒(Miscanthussinensis)[23]、紫花苜蓿(Medicagosativa)[24]、垂穗披碱草(Elymusnutans)[25]、黑麦草(Loliumperenne)[26]等牧草和观赏植物的研究结果一致。其原因可能是干旱胁迫使草地早熟禾根系吸收水分减少，地上部分水分散失率大于地下部的吸收率，进而降低了叶片相对含水量。此外，11种草地早熟禾叶片相对含水量下降幅度存在差异，这与Cao等[27]对12种薄壳山核桃(Caryaillinoensis)的耐旱性评价结果一致。

丙二醛作为植物细胞膜脂质过氧化的产物之一，是反映氧化损伤程度的重要生理指标[28]。大量研究表明，干旱胁迫会导致膜系统氧化损伤，MDA含量增加[29]。本研究结果表明，干旱胁迫下11种不同生境草地早熟禾MDA含量增加，且MDA含量增加幅度不同。干旱胁迫会引起活性氧自由基增加，使植物细胞遭受氧化胁迫，从而导致细胞膜受损并影响植物生长，赵丽丽等[30]报道干旱胁迫引起19种高羊茅(Festucaarundinacea)种质MDA含量上升，这与本研究结果一致。

脯氨酸和可溶性糖是植物体内的渗透调节物质，参与干旱胁迫下植物细胞的渗透调节，可以保护蛋白分子结构和稳定膜结构[31]。宋娅丽等[33]研究发现干旱胁迫下黑麦草、高羊茅和早熟禾幼苗通过增加Pro和SS含量来提高水分吸收。本研究结果显示，干旱胁迫导致草地早熟禾幼苗叶片中Pro和SS含量增加，这种增加可能分别是蛋白质和淀粉降解的结果[32]。同样，曹丽等[34]对草地早熟禾抗旱性指标测定分析的研究得到了相同的结果。

光合作用是植物体生长发育的物质基础。叶绿素作为植物进行光合作用的主要色素，能够主导植物的光合作用，而干旱胁迫会引起叶绿体光合色素含量降低、内囊体膜稳定性和参与光合作用酶活性的改变，导致光合能力下降和光合作用受阻[35]，叶绿素含量的高低能够反映植物的光合特性和抗旱能力[36]。罗彬莹等[37]研究发现干旱胁迫导致樟树(Cinnamomumcamphora)幼苗中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a/b下降，进而引起净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、胞间CO2浓度持续下降。本研究结果表明，干旱胁迫导致11种草地早熟禾幼苗叶片的叶绿素含量均有不同程度的降低，推测原因可能是缺水引起植物光合色素降解，以及合成途径受阻，导致光合色素含量下降。Dalal等[38]证实干旱胁迫引起水稻(Oryzasativa)幼苗5-氨基乙酰丙酸脱氢酶、胆色素原脱氨酶、原卟啉氧化酶3抗体、Mg-原卟啉IX氧化酶和叶绿素氧化还原酶等基因的表达量下调，导致相关酶活性降低，进而抑制了叶绿素生物合成中间体(即谷氨酸-1-半醛(GSA)，5-氨基乙酰丙酸，Mg-原卟啉IX和叶绿素酸酯)的积累。

正常条件下，植物产生的活性氧(ROS)是重要的信号分子，参与植物生长、发育激素反应、逆境胁迫应答和部分生理过程[39]。干旱胁迫下植物气孔关闭，叶片内CO2浓度降低，碳同化被抑制，为维持光合电子传递链的正常运行，O2被直接还原为O2·-，进而积累了过多的ROS[35]。研究表明，SOD、POD和CAT是清除ROS的重要酶，同时也是评价植物抗逆境的重要指标之一[40]。本试验结果表明，干旱胁迫下11种草地早熟禾材料SOD、POD和CAT活性显著升高，不同材料增加幅度不同，其中M10增加幅度最大，这与董沁等[41]的研究结果相一致。

植物抗旱性是由多因素和多基因相互作用构成的一个复杂的性状，利用模糊数学中的隶属函数法对相关抗旱指标进行综合评价，有利于评定出的结果与实际结果较为接近。本试验利用隶属函数法，对11种草地早熟禾种质材料苗期所测定的8个指标进行综合评价，使得评定结果更加全面可靠地反映各种质资源的耐旱性。

4 结论

干旱胁迫下11种草地早熟禾种质材料相对含水量和叶绿素含量显著降低，SOD、POD和CAT活性升高，Pro、MDA和可溶性糖含量增加。通过隶属函数法用11种草地早熟禾种质材料的RWC和Chl含量的相对降低量和MDA、Pro、SS、SOD、POD和CAT的相对增加量进行苗期耐旱性综合评价，耐旱性由强到弱排序依次为M10>M8>M9>M2>M5>M4>M3>M6>M7>M1>M11。因此，M10和M8可作为甘肃省和青海省草地早熟禾选育耐旱品种的候选材料。