燕麦根腐病病原真菌分离鉴定及致病性研究

杨琰珊，姚拓，张建贵，白洁，撖冬荣，李琦，李昌宁，董凯，付卫刚

(甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070)

燕麦(Avenasativa)属禾本科(Gamineae)燕麦属(Avena)一年生粮饲兼用草本作物[1-2]；具有较强的抗逆性与适应性，在世界各地皆有分布[3]。燕麦富含蛋白质、维生素、脂肪等多种营养成分，营养价值较高[4]；可调节血脂、改善血液循环，具有独特的医疗保健功能；其茎秆、叶柔嫩多汁，难以消化的纤维含量低，是农牧区的优良牧草，在畜牧业发展中占有举足轻重的地位[5]。病害是饲用作物生产的主要限制因素之一，能影响作物的产量与品质[6]；燕麦病害在我国及世界燕麦种植区普遍发生，影响燕麦产业的健康稳定发展。

目前我国对于燕麦病害的研究多集中于燕麦植株地上病害，如由禾本科布氏白粉菌(Blumeriagraminis)引起的白粉病[7]、大麦坚黑粉菌(Ustilagohordei)引起的坚黑穗病[8-9]、燕麦内平脐蠕孢(Drechsleraavenacea)与细交链孢(Alternariaalternata)引起的叶斑病[10]、大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus)引起的红叶病[11]等。但对燕麦根腐病的研究相对较少，燕麦根腐病是一种常见的土传病害，该病主要由病原真菌引起；发病初期仅有个别须根感病出现病斑，植株不表现明显症状；后期随根部腐烂程度加剧，导致吸收水分与养分功能减弱，地上部分出现叶片发黄、萎蔫、枯萎等症状，严重时甚至死亡。根腐病病原主要以菌丝体或孢子形式在病残体和土壤中越冬，成为翌年主要初侵染源，从植株根茎处或根部伤口处侵入，通过灌溉水或雨水进行传播与蔓延[12]。

根腐病对多种植物有较强的危害性，研究发现：小麦根腐病能使小麦减产15%～25%，严重地块则能减产30%～70%[13]；李雪萍[14]在甘肃省甘南州和青海省等青稞种植区调查发现，青稞根腐类病害的田间发病率均在5%～20%[14]；三七、白术、黄芪等以地下部位作药用的植物受根腐病危害较大，严重影响其药用价值与经济价值[15]。根腐病病原多样，且不同作物致病菌与致病菌的致病性存在差异，优势病原也不尽相同。研究发现：小麦根腐病病原为麦根腐平脐蠕孢[13](Bipolarissorokiniana)、黄色镰刀菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰刀菌(F.graminearum)、假禾谷镰刀菌(F.pseudograminearum)与木贼镰刀菌(F.equiseti)[16]，其中麦根腐平脐蠕孢为优势病原，其致病力与菌落颜色深浅有关，颜色越深致病力越强[17]，黄色镰刀与禾谷镰刀在多地均有分离，且致病力较强[18]。青稞茎基腐病病原为燕麦镰刀菌(F.avenaceum)、木贼镰刀菌(F.equiseti)、锐顶镰刀菌(F．acuminatum)、柔毛镰刀菌(F.flocciferum)和F.langsethiae[13]，其中麦根腐平脐蠕孢、燕麦镰刀菌和木贼镰刀菌的致病力较强[14]。辣椒根腐病的主要致病菌为半裸镰刀菌(F.semitectum)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、轮枝镰刀菌(F.verticillioides)和茄病镰刀菌(F.solani)，其中尖孢镰刀与茄病镰刀为优势病原且致病性较强，病情指数分别为67.22和66.27[19]。此外，我国对草莓[20]、苜蓿[21]、白及[22]、黄芪[23]等植物根腐病病原皆有研究。

我国对燕麦根腐病的研究见南志标[24]在《中国牧草真菌病害名录》中对燕麦根腐病病原名称有简单报道，且具体分布及致病力强弱不详。鉴于此，以燕麦根腐病病株为材料，对其病原菌进行分离、鉴定及致病性测定，以期明确燕麦根腐病病原菌种类，为燕麦根腐病的诊断和防治提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料来源

将采集于甘肃省通渭县华家岭燕麦主产区的燕麦根腐病病株带回实验室进行病原真菌分离鉴定及致病性测定，以确定燕麦根腐病的致病菌。

1.2 病原真菌的分离纯化

采用组织分离法[25]，将燕麦根腐病病株根部病健交界处剪成0.5 cm的小段，将小段经75%酒精浸泡30 s后，放入1%次氯酸钠中浸泡5 min，用无菌水多次冲洗，最后接于PDA培养基，25℃恒温培养，待长出菌丝后挑取菌落边缘处的菌丝接于新的PDA培养基上进行纯化，反复多次，待纯化好后，将菌株转接于PDA试管斜面，保存于4℃培养箱待用。

1.3 致病性测定

采用水琼脂平皿法[26]对分离真菌进行致病性测定，用柯赫氏法则验证。

挑选颗粒饱满、大小一致的燕麦种子，经75%酒精消毒30 s后，再用1%次氯酸钠消毒8 min，用无菌水反复冲洗干净，待用。

制备WA(水琼脂)培养基：琼脂12 g，水1 L，分别装入1 L三角瓶中，121℃高压灭菌30 min，倒入培养皿中，待用。

将培养好的真菌打成菌饼，接入准备好的WA培养基中心位置，将经消毒的燕麦种子均匀摆放于菌饼周围，且与菌饼保持一定距离；每株培养皿内摆放10粒燕麦种子，每个真菌做3个重复，以不接菌作为对照；置于25℃光照培养箱中，8 d后统计发病情况，测定发病率与病情指数[26]。病害指数分级标准[26]见表1。

发病率=(发病株数/总株数)×100%

病情指数=100×∑(各级发病指数×各级代表值)/(调查总植株数×最高级代表值)

从发病植株根部再次分离病原菌，并与初接种的分离真菌做对比，确定分离真菌是否为致病菌。

表1 病害指数分级标准[26]

1.4 病原真菌的形态学观察

将前期分离纯化好保存于试管斜面的菌株接于PDA培养基，观察其菌落形态、菌丝疏密情况、是否产生色素及色素颜色。挑取少量菌丝，制作临时玻片，用无菌水做浮载剂；将做好的临时玻片置于光学显微镜下，观察分生孢子的形状及大小、产孢细胞及厚垣孢子有无，并拍照。根据病原真菌形态特征，参照《真菌鉴定手册》[27]及《镰刀菌属》[28]等资料进行形态学鉴定。

1.5 分子生物学鉴定

1.5.1 基因组DNA提取 采用Omega真菌DNA基因组试剂盒提取真菌DNA，将培养好的真菌菌丝置于研钵中加入液氮进行研磨，研磨后按试剂盒提供的方法步骤进行操作。将提取的DNA置于-20℃冰箱中保存，待用。

1.5.2 PCR扩增及测序 用真菌通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃延伸10 min。将PCR扩增产物取出5 μL，再用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，随后将PCR产物送往公司进行测序。

1.5.3 系统发育树构建 将测序获得的序列在NCBI上进行BLAST比对，从GenBank数据库中选出最相近的序列进行同源性比较；用Mega 7.0软件构建基于ITS的系统发育树，确定分离菌株与所选菌株的亲缘关系。

2 结果与分析

2.1 病原真菌的分离纯化

选取具有代表性的5株真菌，这5株真菌分离频率较高，分别命名为Y2、Y5、Y13、Y18、Y31。

2.2 致病性测定

采用水琼脂平皿法对5株真菌进行致病性测定，发现5株真菌均能使燕麦致病。其中Y5、Y18及Y31的发病率均为100%，Y2与Y13发病率分别为80.00%和96.67%。病情指数由高至低依次为：Y5(79.67%)>Y31(74.33%)>Y18(71.67%)>Y13(60.00%)>Y2(47.00%)(表2，图1)。将每个处理发病根部进行病原菌再分离，并与初接菌做对比，发现再分离菌与初接菌为同一种菌，符合柯赫氏法则；因此，Y2、Y5、Y13、Y18、Y31为燕麦根腐病的致病菌(图2)。

表2 分离真菌的致病性测定

图1 病害指数分级Fig.1 Classification of disease index

图2 平皿法致病性测定Fig.2 Plate method for pathogenicity determination

2.3 病原真菌鉴定

2.3.1 菌株Y2的鉴定 菌株Y2在PDA培养基菌丝呈白色，生长一段时间后边缘呈蜡黄色，羊绒状(图3-A)，菌落背面呈土黄色(图3-B)，边缘整齐。大型分生孢子呈马特型，顶细胞稍弯，两端较钝，通常有2～5个隔膜，大多数为3隔，量度为(25.34～36.42) μm×(4.67～5.21) μm；小型分生孢子呈卵形或椭圆形，0～1个隔膜，量度为(6.05～14.37) μm×(2.75～4.36) μm；产孢细胞为单瓶梗产孢且瓶梗较长；厚垣孢子为球形，通常对生或串生(图3-C～F)。根据形态特征将Y2初步鉴定为茄病镰刀菌(F.solani)。

菌株Y2经DNA提取、ITS引物扩增测序后，通过Gen-Bank数据库对菌株Y2的碱基序列同已知物种序列进行同源性比对，结果表明Y2与数据库中Fusariumsolani(登录号为MH517680)序列同源性为100%。进一步构建基于ITS的系统发育树，进行系统进化分析，结果表明菌株Y2与Fusariumsolani(登录号为MH517680)聚为同一支，且自展值为99%(图4)；结合形态学特征将Y2鉴定为茄病镰刀菌(Fusariumsolani)。

图3 Y2的形态特征Fig.3 Morphological characteristics of Y2注：A：在PDA上菌落的正面形态；B：在PDA上菌落的背面形态；C：小型分生孢子与分生孢子梗；D、E：分生孢子；F：厚垣孢子

2.2.2 菌株Y5的鉴定 菌株Y5在PDA培养基气生菌丝呈粉白色，中间为黄色，生长速度较快，菌丝较长，羊毛状(图5-A)；菌落背面初期呈红色，边缘为白色，后期呈深红色(图5-B)；边缘整齐。未见小型分生孢子；大型分生孢子为镰刀型，直且细长，4～6个隔膜，多为5个，足细胞明显，顶细胞较细，量度为(40.25～58.73) μm×(3.52～5.64) μm，单瓶梗产孢；厚垣孢子较少，一般间生(图5-C～F)。根据形态特征将Y5初步鉴定为禾谷镰刀菌(F.graminearum)。

图4 基于ITS构建Y2系统发育树Fig.4 Construction of Y2 phylogenetic tree based on ITS注：分支上的数据表示Bootstrap检验的支持百分率，括号内为GenBank序列号；图中标尺代表位点的碱基替代率，下同

图5 Y5的形态特征Fig.5 Morphological characteristics of Y5

菌株Y5经DNA提取、ITS引物扩增测序后；通过Gen-Bank数据库对菌株Y5的碱基序列同已知物种序列进行同源性比对，结果表明Y5与数据库中F.graminearum(登录号为MF800905)序列同源性为100%。进一步构建基于ITS的系统发育树，进行系统进化分析，结果表明菌株Y5与F.graminearum(登录号为MF800905)聚为同一支，且自展值为97%(图6)；结合形态学特征将Y5鉴定为禾谷镰刀菌(F.graminearum).

图6 基于ITS构建Y5系统发育树Fig.6 Construction of Y5 phylogenetic tree based on ITS

2.2.3 菌株Y13的鉴定 菌株Y13在PDA培养基上菌丝呈白色或淡粉色，中间带有紫色，棉絮状(图7-A)；菌落背面初期呈紫色，边缘为白色，后期为深紫色(图7-B)；边缘整齐。小型分生孢子呈卵形或纺锤形，数量较多，常串生或假头状着生，0～1个隔膜，量度为(3.17～14.76) μm×(1.85～3.32) μm。产孢细胞为复瓶梗产孢，大型分生孢子不易产生，2～4隔，量度为(18.54～20.36) μm×(3.12～4.50) μm；无厚垣孢子产生(图7-C～F)。根据形态特征将Y13初步鉴定为串珠镰刀菌(F.moniliformi)。

图7 Y13的形态特征Fig.7 Morphological characteristics of Y13注：A、B：在PDA培养基上的正反面；C：小型分生孢子；D：大、小型分生孢子；E：小型分生孢子串状着生；F：产孢细胞

菌株Y13经DNA提取、ITS引物扩增测序后，通过Gen-Bank数据库对菌株Y13的碱基序列同已知物种序列进行同源性比对，结果表明Y13与数据库中Gibberellamoniliformi(登录号为JF499683)序列同源性为99%。进一步构建基于ITS的系统发育树，进行系统进化分析，结果表明菌株Y13与G.moniliformi(登录号为JF499683)聚为同一支，且自展值为92%(图8)；G.moniliformi是串珠镰刀菌(F.moniliformi)有性时期的名称，因此，结合形态学特征将Y13鉴定为串珠赤霉菌(G.moniliformi)。

图8 基于ITS构建Y13系统发育树Fig.8 Construction of Y13 phylogenetic tree based on ITS

2.3.4 菌株Y18的鉴定 菌株Y18在PDA培养基上，菌丝为粉白色，略带浅粉色，毡状(图9-A)，菌落背面呈深红色(图9-B)，边缘整齐。大型分生孢子较多，呈镰刀型，细长，两端较尖，3～6个隔膜，量度为(22.59～48.83) μm×(2.65～4.86) μm。小型分生孢子为卵形、棒形或长椭圆形，可假头状着生，1～2个隔膜，量度为(7.85～18.05) μm×(1.57～3.37) μm(图9-C～图9-E)。厚垣孢子为球形，常串生(图9-E)。根据形态特征将Y18初步鉴定为镰刀菌。

图9 Y18的形态特征Fig.9 Morphological characteristics of Y18注：A、B：在PDA培养基上的正反面；C：小型分生孢子；D：大型分生孢子；E：小型分生孢子假头状着生；F：厚垣孢子

菌株Y18经DNA提取、ITS引物扩增测序后，通过Gen-Bank数据库对菌株Y18的碱基序列同已知物种序列进行同源性比对，结果表明Y18与数据库中G.acuminata(登录号为EF531234)序列同源性为99%。进一步构建基于ITS的系统发育树，进行系统进化分析，结果表明菌株Y18与G.acuminata(登录号为EF531234)聚为同一支，且自展值为81%(图10)；有些镰刀菌的有性时期为赤霉菌，因此，结合形态学特征将Y18鉴定为G.acuminata。

图10 基于ITS构建Y18系统发育树Fig.10 Construction of Y18 phylogenetic tree based on ITS

2.3.5 菌株Y31的鉴定 菌株Y31在PDA培养基上气生菌丝从中间向边缘由粉色渐变为白色，棉絮状(图11-A)；菌落背面为红色或红褐色，颜色由中间向边缘逐渐变浅(图11-B)；边缘不整齐。大型分生孢子呈线型，直且细长，4～7个隔膜，多为5隔，量度为(30.06～44.41) μm×(3.51～5.24) μm。未看到小型分生孢子和厚垣孢子(图11-C，图11-D)。根据形态特征将Y31初步鉴定为燕麦镰刀菌(F.avenaceum)。

图11 Y31的形态特征Fig.11 Morphological characteristics of Y31注：A、B：在PDA培养基上的正反面；C、D：大型分生孢子

菌株Y31经DNA提取、ITS引物扩增测序后；通过Gen-Bank数据库对菌株Y31的碱基序列同已知物种序列进行同源性比对，结果表明Y31与数据库中F.avenaceum(登录号为EF531234)序列同源性为100%。进一步构建基于ITS的系统发育树，进行系统进化分析，结果表明菌株Y31与F.avenaceum(登录号为EF531234)聚为同一支，且自展值为80%(图12)；因此，结合形态学特征将Y31鉴定为燕麦镰刀菌(F.avenaceum)。

图12 基于ITS构建Y31系统发育树Fig.12 Construction of Y31 phylogenetic tree based on ITS

3 讨论

本研究从燕麦根腐病病株中分离并选取5株具有代表性的真菌，经致病性测定，分离菌株Y2、Y5、Y13、Y18、Y31均能使燕麦根部变色；对变色根部进行病原菌再分离，其形态特征与初接菌相一致，符合柯赫氏法则；即Y2、Y5、Y13、Y18、Y31为燕麦根腐病致病菌。采用传统分类方法鉴定真菌有一定难度和不确定性；而分子生物学鉴定方法可以弥补传统分类鉴定方法中的不足，对病原菌进行快速准确的鉴定[29-30]。rDNA-ITS是介于18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之间的区域，该区域进化速度较编码区快，被普遍用来进行真菌种间或种内遗传相似性的分子系统研究[31-32]；具有高度保守性，是鉴定真菌较好的辅助手段[33]。本研究通过形态学特征与rDNA-ITS序列分析相结合，分别将Y2、Y5、Y13、Y18、Y31鉴定为茄病镰刀菌、禾谷镰刀菌、串珠赤霉菌、G.acuminata、燕麦镰刀菌。在我国仅有南志标[24]对燕麦根腐病病原做了简单的名称报道，报道燕麦镰刀菌、大刀镰刀菌(F.culmorum)、禾谷镰刀菌、雪腐镰刀菌(F.nivale)、长直喙镰刀菌(F.orthoceras)、早熟禾镰刀菌(F.poae)、藤草镰刀菌(F.scripi)为燕麦根腐病病原，本研究从燕麦病株中只分离出燕麦镰刀菌和禾谷镰刀菌，而对于所报道的其余5种镰刀菌未曾分离。其原因可能是不同地区、不同菌株的生存环境不同所致。此外，本研究发现茄病镰刀菌、串珠赤霉菌、G.acuminata引起燕麦根腐病为国内首次报道。

本研究通过致病性试验，明确了各菌株的致病性，特别是Y5(禾谷镰刀菌)，对燕麦致病力最强，发病率为100%，病情指数为79.67。禾谷镰刀菌是玉米苗期根病和小麦赤腐病的主要致病菌，对玉米和小麦致病力较强[34-35]；这与本研究结论相一致。原因可能是：禾谷镰刀菌在侵染和扩展过程中可分泌产生细胞壁降解酶类，这些酶可降解植物细胞壁中的多聚碳水化合物，离解细胞壁，破坏原生质，毁坏整个细胞结构[36]；此外，禾谷镰刀菌可产生单端孢霉烯毒素，其主要组分是脱氧雪腐镰刀菌烯醇，它能抑制核酸复制与蛋白质合成，抑制线粒体功能，破坏细胞膜完整性，抑制种子萌发、根系生成、根茎及愈伤组织的生长[37]。Y18(G.acuminata)与Y31(燕麦镰刀菌)对燕麦致病力较强，病情指数分别为71.67和74.33，朱海霞[38]研究发现燕麦镰刀菌能使野燕麦、小麦及青稞中度感病，使蚕豆、豌豆、油菜轻度或不感病；原因可能是禾本科植物根际能够分泌某种物质诱导燕麦镰刀菌入侵，使其对禾本科作物致病力较强，而对其他作物无致病性或致病力较弱。Y2(茄病镰刀)与Y13(串珠赤霉)使燕麦病情指数分别为47.00与60.00，茄病镰刀菌为多种植物根腐病的优势病原，但其致病力相对较弱或为中等[21]；串珠赤霉菌是甘蔗梢腐病与水稻恶苗病的主要病原，对甘蔗和水稻致病力较强[39]，与本结论相一致，这可能与它自身产生串珠镰刀菌素、伏马菌素及镰刀菌酸等多种毒素[40]有关。此外，本研究采用水琼脂平皿法测定其致病性，有研究发现分别采用水琼脂法与盆栽法测定菌株致病性，前者高于后者，但发病率及致病性趋势一致[14]；但也有研究发现两者并无差异[19]。由于存在差异性，后期将通过盆栽法验证其致病性。根腐病病原种类复杂，常由多种病原菌复合侵染引起病害，本研究仅采用单一菌株接种燕麦种子进行致病性测定，为更深入了解燕麦根腐病的发病机制，需利用多种致病菌同时接种开展进一步研究。

近年来，研究者针对植物根腐病的生物防治已有相关研究，主要通过利用有机肥、植物提取液或生防菌等手段对根腐病致病菌菌丝进行生长抑制[23]。本研究后期已筛选出对燕麦根腐病致病菌有生防作用的细菌，由于植物真菌病害是影响农业发展的主要问题[41]，因此，本研究为后续对燕麦根腐病防治研究奠定了基础。

4 结论

(1)结合形态学和分子生物学的鉴定，Y2为茄病镰刀菌(F.solan)、Y5为禾谷镰刀菌(F.gramineae)、Y13为串珠赤霉菌(G.moniliformi)、Y18为G.acuminata、Y31为燕麦镰刀菌(F.avenaceum)。

(2)茄病镰刀菌、G.acuminata、串珠赤霉菌引起燕麦根腐病为国内首次报道。

(3)水琼脂平皿法致病性测定表明5株菌均能使燕麦致病，且禾谷镰刀菌致病力最强，病情指数为79.69。