“天然药物化学”实验教学过程中科研反哺教学的实践

赵杰　吕洁丽　张涛　刘兆敏

摘 要 “天然药物化学”是药学专业中理论和实践并重的专业基础课。针对实验课程教学现状和不足，提出在教学过程中实施科研反哺教学，将科研精神用于教学，将科研成果引入课堂及开展实验、科研课题等方式，以改进“天然药物化学”课程教学质量，培养学生综合素质。本文以冬凌草甲素的提取、分离和结构鉴定为例，进行科研反哺教学的探索和实践。

关键词 天然药物化学 科研反哺教学 冬凌草甲素

中图分类号：G424                                 文献标识码：A  DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2021.02.040

Practice of Research Feedback Teaching in Experimental Teaching

of Natural Medicinal Chemistry

——Take the extraction， isolation and structure identification of oridonin as an example

ZHAO Jie， LV Jieli， ZHANG Tao， LIU Zhaomin

（Sanquan Medical College， Xinxiang， Henan 453003）

Abstract "Natural medicinal chemistry" is a basic course which emphasizes both theory and practice in pharmacy. In view of the current situation and shortcomings of experimental teaching， this paper proposes to implement scientific research feedback teaching in the teaching process， apply scientific research spirit to teaching， introduce scientific research achievements into the classroom and carry out experiments and scientific research projects， so as to improve the teaching quality of natural medicinal chemistry and cultivate students' comprehensive quality. Taking the extraction， separation and structure identification of oridonin as an example， this paper explored and practiced the teaching of scientific research feedback.

Keywords natural medicinal chemistry; scientific research nurtures teaching; oridonin

天然藥物化学就是运用现代科学理论与方法研究天然药物中化学成分的一门学科。其研究内容包括天然产物中化学成分的提取、分离、结构鉴定、理化性质分析、生物合成途径和生物活性研究等多个方面。天然药物化学是一门实践性很强的学科，实验教学在天然药物化学教学中占据着重要的地位。[1]

我们药学院药物化学教研室，针对天然药物化学实验教学中发现的问题，结合实验教学内容和教师的科研项目。本文以冬凌草甲素的提取、分离和结构鉴定为例，在教学过程中实施研究型教学，将科研方法和技术、科研成果渗入到天然药物化学教学中。通过“科研反哺教学”创新人才培养模式的实践，不仅让药学专业的学生加深理解课本上抽象的理论知识，还可以掌握天然药物中有效成分的提取、分离、精制与鉴定的基本方法和技能实验操作，更重要的是提高和增强学生动手创新能力、动手能力和自学能力。[2]

1 实验背景

冬凌草为唇形科香草菜属多年生草本植物，产于河南太行山南麓。冬凌草具有清热解毒、消炎止痛及抗肿瘤之功效。《中国土特产大全》《中华人民共和国药典》分别将其收录。[3]现代医学研究表明冬凌草的药用成分主要是冬凌草甲素（oridonin），其结构见图 1。冬凌草甲素是具有中等极性的7，20-环氧型对映-贝壳杉烷类二萜化合物。1972年，中国食管癌研究中心，发现冬凌草具有独特的抗食管癌，贲门癌、原发性肝癌功效，从此被广泛应用于临床。[4]由于我省的冬凌草资源尤为丰富，近几年来，我们学校天然药物化学组多年一直致力于冬凌草和同属香茶菜属植物的化学成分及生物活性研究，发表了众多的相关科研论文，[5-10]不仅为“天然药物化学”理论和实验教学提供了学术能力，也积极将科学研究优势转化为教学优势。

2 实验方案的设计和安排

2.1 实验方案的设计

学生文献查阅，冬凌草甲素是中等极性的二萜类化合物，其D环具有 ， -不饱和环戊酮结构，该结构不稳定。根据其物理化学性质，从冬凌草中提取冬凌草甲素的方式主要是采用溶剂提取法，如：冷浸法，加热回流法，以及超声波辅助萃取法等。溶剂提取得到的浸膏分离提纯冬凌草甲素的方法，主要有硅胶色谱柱分离法、大孔吸附树脂分离法、活性炭回流法等。冬凌草甲素的结构鉴定，主要以TLC 方法，与冬凌草甲素标准品进行对照。

2.2 仪器和试剂

仪器：层析柱（25mm？00mm），分液漏斗（500ml），旋转蒸发仪，圆底烧瓶（100ml、24#，2个;250ml，29#，1个），缓冲瓶（24#/29#），硅胶GF254薄层层析板，层析缸，电吹风，滴管，量筒（100ml，10ml），台秤，电炉，镊子，纱布，脱脂棉，青霉素瓶。

试剂：柱层析硅胶（200-300目），5%浓H2SO4/无水乙醇溶液，冬凌草甲素标准品，乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮。

2.3 实验步骤

2.3.1 提取

冷浸法：将粉碎后的200g冬凌草叶用70%丙酮/水1000ml室温浸泡3天，共提取2次，合并2次提取液。将提取液减压浓缩至无丙酮味，水液放置两天使色素沉淀，过滤除去色素，滤液用乙酸乙酯150ml萃取1次，减压浓缩乙酸乙酯萃取液至干燥起泡，得粉末状浸膏。

超声波辅助提取法：将粉碎后的200g冬凌草叶用70%丙酮/水1000ml在超声波提取器提取2次，每次30min。将2次提取液减压浓缩至无丙酮味，冷却，水液放置两天使色素沉淀，过滤除去色素，滤液用乙酸乙酯150ml萃取1次，减压浓缩乙酸乙酯萃取液至干燥起泡，得粉末状浸膏。

加热回流法：将粉碎后的冬凌草叶200g用85%乙醇溶液500ml加热回流2次，每次1h，将提取液减压浓缩至干。浸膏加水溶解，水液放置两天使色素沉淀，过滤除去色素。然后用乙酸乙酯150ml萃取1次，减压浓缩乙酸乙酯萃取液至干燥起泡，得粉末状浸膏。

2.3.2 柱层析分离

取上述粉末状浸膏2.0g，用甲醇完全溶解，3.0g硅胶拌样，干燥后，干法上柱，上柱用硅胶40g。用氯仿/甲醇（20：1）洗脱，每次流分体积为50ml，收集总流分体积约300ml时，冬凌草甲素被洗脱下来，减压浓缩析晶，可得无色晶体。

2.3.3 重结晶

用丙酮可纯化出冬凌草甲素。

2.3.4 TLC鉴定

样品：冬凌草甲素标准品。

展开剂：氯仿/甲醇（10：1）溶液。

TLC薄层用5%浓H2SO4/无水乙醇显色，与标准品对照进行鉴定。

2.4  实验结果与讨论

冬凌草因其入药部位为全草，溶剂提取液中含有大量叶绿素，对冬凌草甲素的提取和分离造成了困难。学生参考了大量的文献后，设计了三种可行的冬凌草甲素的提取方案，分别70%丙酮/水室温浸泡提取，该方法在提取过程中，可过滤除去大量的叶绿素，有利于后续的纯化分离。冷浸法有助于提取对高温下结构不稳定的化合物，提取率高，但提取时间较长。我们同样用70%丙酮超声辅助提取法，该法缩短了提取的时间、提取液中杂质和色素较少。目前广泛使用乙醇热回流法，该法提取物中极性范围广，杂质较多，色素中，增加后续分离难度。

针对色素去除方法，有用石油醚去除色素，脱色效率低;采用活性炭脱色效果好，但容易造成冬凌草甲素的产率下降。我们采用柱色谱的方法，该法简单直接。根据冬凌草甲素的理化性质，学生设计了三种不同的冬凌草甲素的提取方法，根据实验结构的比较分析，不仅能让学生加深天然化合物的多种提取分离方法，还增强他们的动手能力和独立思考能力。

3 结论

冬凌草甲素作为一种副作用小的防癌抗癌药物，在国际国内市场需求量很大。因此冬凌草甲素的提取分离和活性研究尤为重要。我们天然药物化学组一直致力于冬凌草及其相关属植物的化学成分研究，我们将典型的冬凌草甲素的提取、分离和结构鉴定引入到“天然药物化学”实验教学过程中。学生根据实验要求亲自参与设计实验方案，结合文献设计了三种冬凌草甲素的提取分离方法，并验证了方案可行性。科研反哺教学的实践可以调动学生学习积极性，培养实验操作能力强的学生，使其今后能胜任工作岗位和为祖国传统医药事业做贡献的需求。

项目基金：新乡医学院教育教学改革研究项目，编号2017-XYJG-32

参考文献

[1] 吕洁丽，张来宾，白素平，等.线上线下多元化教学模式在天然药物化学教学改革中的应用[J].药学教育，2019，35（3）：41-44.

[2] 尚丽平.浅谈教学与科研的关系[J].西南科技大学高教研究，2007，82（1）：15-16.

[3] 河南省医学科学研究所，河南医学院，云南植物研究所，一种新的抗肿瘤物质——冬凌草素[J].科学通报，1978，23（1）：122.

[4] 孙汉董，许云龙，姜北.香茶菜属植物二萜化合物[M].北京：科学出版社，2001.

[5] HouRJ，Yan FL，ZhangHY，BaiYX，DingMM，Two new diterpenoids and other constituents from Isodonrubescens[J].Fitoterapia，2011，（82）4：726-730.

[6] 尚校军，董若怡，马素英，等.冬凌草甲素固体分散体的制备及溶解性能研究[J].中国现代应用药学，2010，27 （5）：418-421.

[7] Yan FL，GuoLQ，WangCM，et al.Chemical constituents of Isodonnervosus and their cytotoxicity[J].Journal of Asian natural products research，2009，11（4）：326-331.

[8] 袁永亮.河南狭苞橐吾和冬凌草化学成分及生物活性研究[D].新乡医学院，2009.

[9] 謝瑞杰.冬凌草和溪黄草化学成分及生物活性研究[D].新乡医学院，2008.

[10] Yan FL，Wang CM，Guo LQ，et al. A new ent-kauranediterpenoid from Isodonnervosus[J].Journal of Chemical Research，2008，（9）：522-524.