疏肝调神针法对偏头痛模型大鼠血管活性物质和腺苷A1受体表达的影响❋

黄绍磊，王苏瑶，王萌萌，韩 晶,3△，杨佃会,3△

(1. 山东中医药大学针灸推拿学院，济南 250014； 2. 济南市历下区人民医院，济南 250014； 3. 山东中医药大学附属医院，济南 250011)

偏头痛是一种常见的慢性、反复发作的神经系统疾病，以单侧或双侧发作性、持续性、搏动性头痛为主要临床表现，给患者造成了严重的身心伤害，同时加剧了社会经济负担[1-4]。偏头痛的病因尚未完全明确，可能与血管、神经、内分泌、免疫及遗传等因素有关[5-8]。现代医学尚未有理想的治疗方法，多以非甾体抗炎类、曲普坦类、钙通道拮抗剂等药物治疗以缓解症状和预防发作，但用药周期长、药物依赖性严重且伴有一定的副作用[9-10]。针刺治疗偏头痛的疗效确切[11]。疏肝调神针法是全国名老中医单秋华教授用于治疗疼痛类疾病的临证经验，疗效显著[12-13]。本研究通过观察疏肝调神针法对偏头痛大鼠行为学、外周血中血管活性物质5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、P物质(substance P，SP)及三叉神经脊束核中腺苷A1受体(adenosine A1 receptor，ADORA1)基因和蛋白表达的影响，探讨其可能的作用机制，为临床治疗提供科学依据。本研究已通过山东中医药大学实验动物伦理委员会审批。

1 材料

1.1 实验动物

SPF级健康Wistar雄性大鼠32只，体质量(200～240) g，购自济南彭悦公司，生产许可证号scxk鲁20140007。于山东中医药大学附属医院SPF级实验中心饲养操作，控制温度为20～25 ℃，湿度50%～60%，自由饮水饮食。

1.2 主要试剂及仪器

硝酸甘油注射液(1 ml:5mg，北京益民药业有限公司)；Rat 5HT ELISA Kit(CSB-E08364 r)、Rat CGRP ELISA Kit(CSB-E08211 r)、Rat SP ELISA Kit(CSB-E08358 r),武汉华美生物工程有限公司)；ADORA1 Antibody(ab82477,美国abcam公司)；华佗牌针灸针(φ0.3×15 mm，苏州医疗用品厂有限公司)。

PCR仪(IT041-0002，上海依科赛生物制品有限公司)；微量分光光度计(MINIDROP，上海依科赛生物制品有限公司)；超纯水仪(1.5 LPM，美国Millipor synergy)；离心机(techcomp CT15RT，北京格瑞恩科技发展公司)；病理切片机(RM2016型，上海徕卡仪器有限公司)；石蜡包埋机(JB-P5型，武汉俊杰电子有限公司)。

2 方法

2.1 分组

适应性喂养1周后，将32只Wistar大鼠按随机数字表法分为对照组、模型组、普通针刺组、疏肝调神组每组各8只。

2.2 干预方法

各组大鼠每天抓取固定30 min，同时根据全国普通高等教育中医药类精编教材《实验针灸学》[14]确定大鼠穴位并进行针刺。疏肝调神组：选取风池(双)、百会、太冲(双)、内关(双)，穿透大鼠皮肤约1～2 mm，百会、风池斜刺；内关、太冲直刺，留针30 min。普通针刺组：参照全国普通高等教育中医药类精编教材《针灸治疗学》[15]头痛病症，选取百会、风池(双)，操作同上，连续7 d，第8天造模。

2.3 造模

对照组于大鼠颈后皮下注射0.9%氯化钠注射液0.5 mg。其余各组均参照经典硝酸甘油造模法[16]，于大鼠颈后皮下注射硝酸甘油注射剂(5 mg/kg)，制备实验性偏头痛大鼠模型。造模成功标准：造模10～20 min后给药大鼠出现前肢频繁挠头、双耳发红、咬尾、爬笼次数增多、往返运动增多等[17]。

2.4 观察指标及检测方法

2.4.1 行为学评分 记录各组大鼠挠头、咬尾、爬笼、往返运动的次数，每个症状1次记1分，进行行为学评分[13]。大鼠造模前0～30 min第1次评分，30～60 min造模，60～90 min第2次评分，90～120 min抓取固定或针刺，120～150 min第3次评分。

2.4.2 血清5HT、CGRP、SP含量 行为学评分结束后将大鼠称重，用10%水合氯醛40 mg/kg腹腔注射麻醉，取腹腔静脉血5 mL，放入离心机中4℃4000 r/min离心5 min后取血清，使用ELISA试剂盒检测5HT、CGRP、SP浓度，严格按照说明书进行实验操作。

2.4.3 ADORA1的mRMA表达 荧光定量PCR法检测三叉神经脊束核中ADORA1的mRMA表达：将大鼠行急性断头取脑术，切取部分三叉神经脊束核，加液氮充分研磨，加入1 ml TRIpure LS Reagent，充分吹打混匀。提取RNA，以吸光度法测RNA浓度及纯度。用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，cDNA模板2 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，2 mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。引物序列：ADORA1：上游5′-CTCTCCGGTACAAGACAGTGGTG-3′；ADORA1：下游5′-CACACTTGATCACGGGCTCC-3′；GAPDH：上游5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′；GAPDH：下游5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′。PCR仪中95 ℃预变性10 min，95 ℃变性20 s， 56 ℃退火30 s，72℃20 s延伸，40个循环。以GAPDH为内参，2-△△Ct计算各组mRNA相对表达量。

2.4.4 ADORA1蛋白表达 免疫组化法检测三叉神经脊束核中ADORA1蛋白表达：取部分三叉神经脊束核置4%多聚甲醛液4 ℃冰箱中固定后，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、烘干等步骤制备石蜡切片。切片常规脱蜡至水，3%H2O2室温孵育5～10 min，热修复抗原，冷却后PBS洗片1～2次, 加5%正常山羊血清封闭液室温20 min，加入1∶1000稀释的ADORA1抗体4°C过夜，PBS冲洗5 min×3次，滴加二抗，37 ℃孵育30 min，加辣根酶标记，DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染、脱水、透明、封片，400倍显微镜下观察，每张切片选取3个视野，计算阳性细胞累积光密度值。

2.5 统计学方法

3 结果

3.1 各组大鼠行为学比较

表1示，造模前第1次评分各组大鼠行为学比较无差异。造模后第2次评分模型组行为学均较对照组明显升高(P<0.05)，疏肝调神组、普通针刺组评分明显低于模型组(P<0.05)；疏肝调神组与普通针刺组评分比较略低，差异无统计学意义(P>0.05)。第3次评分疏肝调神组、普通针刺组明显低于模型组(P<0.05)，而疏肝调神组评分略低于普通针刺组，差异无统计学意义(P>0.05)。疏肝调神组、普通针刺组第3次评分均较第2次评分有明显降低(P<0.05)。

表1 大鼠行为学评分比较

3.2 各组大鼠血管活性物质含量比较

图1示，与对照组比较，模型组血清5-HT含量明显降低，SP、CGRP含量明显升高(P<0.05)；与模型组比较，疏肝调神组和普通针刺组5-HT含量明显升高，SP、CGRP含量明显降低(P<0.05)；与普通针刺组比较，疏肝调神组大鼠血中5-HT、SP、CGRP含量均有明显改变(P<0.05)。

注：与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：△P<0.05；与普通针刺组比较：▲P<0.05

3.3 各组大鼠三叉神经脊束核中ADORA1的mRNA表达比较

图2示，与对照组比较，模型组大鼠三叉神经脊束核中ADORA1的mRNA表达明显降低(P<0.05)；与模型组比较，疏肝调神组、普通针刺组大鼠三叉神经脊束核中ADORA1的mRNA表达均明显升高(P<0.05)；与普通针刺组比较，疏肝调神组大鼠三叉神经脊束核中ADORA1的mRNA表达明显升高(P<0.05)。

注：与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：△P<0.05；与普通针刺组比较：▲P<0.05

3.4 各组大鼠三叉神经脊束核中ADORA1免疫组化阳性表达比较

图3、4示，与对照组比较，模型组大鼠三叉神经脊束核中ADORA1免疫组化阳性细胞累积光密度明显降低(P<0.05)；与模型组比较，疏肝调神组、普通针刺组大鼠三叉神经脊束核中ADORA1免疫组化阳性细胞累积光密度均明显升高(P<0.05)；与普通针刺组比较，疏肝调神组大鼠三叉神经脊束核中ADORA1免疫组化阳性细胞累积光密度明显升高(P<0.05)。

注：与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：△P<0.05；与普通针刺组比较：▲P<0.05

图4 三叉神经脊束核中ADORA1免疫组化阳性细胞(×400)

4 讨论

疏肝调神针法是全国名老中医单秋华教授的重要学术经验，用于治疗偏头痛临床疗效显著，现已被广泛应用于各种痛证的治疗。本法重视疏肝与调神，治疗偏头痛时在基础选穴上加太冲以疏肝，百会、内关以调神。太冲为肝经原穴，可疏肝理气，气机畅则头痛止；百会为调神要穴，可开窍醒神以止头痛；内关为心包经络穴，可宽胸理气、调心醒神以治头痛，诸穴相配增强止痛之效。

三叉神经血管学说是目前偏头痛的主流学说，以硝酸甘油造模可较好地维持痛觉过敏的状态，诱导神经源性炎性反应，模拟三叉神经血管炎性学说[17]。本研究造模后大鼠行为学第2次评分疏肝调神组、普通针刺组均明显低于模型组，说明针刺对偏头痛的发作具有一定的预防作用；第3次评分疏肝调神组、普通针刺组明显低于模型组，且明显低于第2次评分，说明针刺对偏头痛的即时镇痛作用显著；且此2次评分疏肝调神组均略低于普通针刺组，差异无统计学意义。猜测其可能由于观察时间较短及样本量限制，从行为学观察疏肝调神针法较普通针刺优势尚不明显[13]。

5-HT是经典的镇痛物质，大量的实验揭示了5-HT在痛觉调制过程中的作用。5-HT作为神经系统中重要的神经递质，在人体中枢神经系统及外周组织中广泛分布。在偏头痛发作时，5-HT从血小板中释放出来，血浆内5-HT含量出现一过性升高，随后其附着于血管壁上，随即血浆内5-HT含量逐渐降低，引起颅内血管出现反跳性舒张，进而导致患者出现搏动样头痛[18-19]。CGRP是一种具有神经细胞保护作用和强大舒血管作用的调节肽，其广泛存在于中枢和外周神经系统中，其在外周参与伤害性信号的传递及痛觉敏化的形成[20]。研究发现，偏头痛发生时血浆CGRP水平的升高与疼痛程度和持续时间呈正相关[21]。SP属速激肽家族中的一种，通过受体与多种第二信使系统偶联，发挥神经递质与调质的作用，参与痛觉调制、感觉信息传递、神经内分泌及心血管活动等复杂的生理功能[22]。SP可与其受体结合引起神经细胞兴奋、敏感性升高，诱发神经内分泌和免疫作用，刺激中枢的炎性因子的分泌，血管通透性升高，血管扩张而引起神经炎性痛，导致偏头痛的发作。临床研究发现，偏头痛患者血浆中SP含量明显高于普通人[23]。本研究中以硝酸甘油造模后，模型组较对照组血中5-HT含量明显降低，CGRP、SP的含量明显升高，提示5-HT、CGRP、SP均参与偏头痛的发生。针刺后，疏肝调神组、普通针刺组血中5-HT含量明显高于模型组，CGRP、SP含量明显低于模型组，且疏肝调神组较普通针刺组变化更明显，提示针刺治疗偏头痛的机制与调节5-HT、CGRP、SP含量有关，且疏肝调神针法对其调节作用更显著，通过5-HT、CGRP、SP共同参与调节血管的收缩与舒张，达到镇痛效果。

腺苷是一种重要的神经递质和调质，其通过与特异的受体结合，参与体内多个系统疾病的病理生理过程。研究证实，腺苷对炎性疼痛及神经性疼痛均有效，主要通过ADORA1实现。ADORA1广泛分布于人体各个系统，但在神经系统中分布最多。现有研究表明，ADORA1可通过多种信号传导通路产生镇痛作用。ADORA1是一种重要的内源性信号传导分子，在各种伤害性刺激发生时，其通过激活G蛋白偶联受体调节细胞内阳离子的跨膜流动，进而影响神经元的兴奋性与递质的释放，发挥镇痛、抗炎等作用。研究表明，侧脑室注射ADORA1激动剂对硝酸甘油偏头痛模型大鼠具有明显镇痛作用[24-25]。本研究中造模后三叉神经脊束核中ADORA1的mRNA及免疫组化阳性表达均明显降低，针刺后均明显升高，且疏肝调神组较普通针刺组变化更明显，表明针刺对偏头痛的治疗作用与调节三叉神经脊束核中ADORA1的含量有关，且疏肝调神针法对其调节作用更显著，其镇痛机制可能是ADORA1与腺苷结合，在突触前后发挥抑制作用，减少伤害性刺激在中枢的传导，影响神经递质及血管活性物质的释放，从而抑制三叉神经系统激活，减少神经源性炎症反应及中枢敏化的产生。综上，疏肝调神针法对偏头痛有良好的防治作用，作用机制可能是通过三叉神经血管系统，调节三叉神经脊束核中ADORA1及血中5-HT、CGRP、SP含量，发挥镇痛作用，且相较于普通针刺作用更明显。未来将做进一步研究，深入探讨针刺镇痛的机制。