HPLC法测定中药袋中4种抗氧剂的含量及其迁移

王小艳，张 涛，李 鹏

(安阳市食品药品检验检测中心，安阳 455000)

中药袋主要由聚乙烯(polyethylene，PE)和聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate，PET)材料组成[1]，具有质轻、稳定性好、使用方便等特点。由于PE和PET材料在成型和使用过程中受到热、光、射线等因素的影响而容易老化，因此在生产过程中常常会加入抗氧剂予以改善、抑制或延缓其老化过程。抗氧剂有明确的生物毒性，对人体肝、脾、肺等均有不良影响。其相对分子质量较小，分散在聚乙烯结构中，可能溶入药液，产生非预期的不良反应，甚至可与药物反应降低疗效[2]。目前，国内尚没有中药袋中抗氧剂的检测方法，也没有考虑抗氧剂的迁移量[3]。本实验采用高效液相色谱(HPLC)法测定中药袋中抗氧剂1010、330、1076、168的含量及对迁移量进行监测[4-10]，以期为中药袋的质量研究提供参考依据。

1 材料

1.1 药品与试剂

抗氧剂1010、168(Sigma-Aldrich公司，批号MKBS0720V、MKBL6586V，纯度98%)；抗氧剂330[梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，批号HBENN-NK，纯度95.0%]；抗氧剂1076(北京百灵威科技有限公司,批号L740Q63，纯度99%)；甲醇、乙腈(J.T.Baker公司，色谱纯)；其他试剂均为分析纯；超纯水为 Molecular 纯水机制备；样品购于市场。

1.2 仪器

e2695高效液相色谱仪、2998 PDA检测器(美国Waters公司)；XS205DU电子天平(瑞士梅特勒-托利多有限公司)；RV10 control旋转蒸发仪(艾卡仪器设备有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters ZORBAX eclipse XDB C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇为流动相；采用Waters 2998 PDA检测器，检测波长274 nm，流速1.0 ml/min，柱温25 ℃。色谱图见图1。

1:抗氧剂1010；2:抗氧剂330；3:抗氧剂1076；4:抗氧剂168

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品抗氧剂1010、330、1076、168适量，以二氯甲烷与乙腈(1∶1)为溶剂，制备成每 1 ml 分别含10 μg抗氧剂1010、100 μg抗氧剂330、100 μg抗氧剂1076、100 μg抗氧剂168的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1提取试验供试品溶液的配制

将中药袋剪成1 cm×1 cm的小块，精密称取7.5 g，加入乙腈80 ml，精密称定。水浴回流5 h，冷却后用乙腈补足重量，过滤，旋转蒸发浓缩至近干，用乙腈溶解并定容至2 ml量瓶中，滤过，即得。

2.3.2迁移试验供试品溶液的配制

取本品，按照标示量分别装入90 ℃的模拟浸泡液(水、pH 3.5缓冲液、pH 8.0缓冲液)，保温30 min后放至室温。分别于0、3和7天取样。取1药袋，将模拟浸泡液旋转蒸发浓缩至近干，用乙腈溶解并定容至1 ml量瓶中，滤过，作为迁移试验供试品溶液。

2.4 线性关系

分别取4种抗氧剂系列对照品溶液，在“2.1”色谱条件下，精密吸取10 μl，分别注入色谱仪中，测定色谱峰面积。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。可知每种抗氧剂在各自范围内线性关系良好。见表1。

表1 4种抗氧剂线性关系

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μl，连续进样6次。测得抗氧剂1010、330、1076、168峰面积的RSD分别为1.5%、1.6%、1.8%、0.8%。

2.6 稳定性试验

精密吸取同一样品溶液10 μl，分别在0、2、4、6、8、10和12 h进样，测得抗氧剂1010、1076、168峰面积的RSD分别为1.4%、0.6%、1.3%。表明样品溶液在12 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

精密称取同一样品，按照“2.3.1”项下方法平行制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件测定峰面积，结果样品中抗氧剂1010、1076、168含量的RSD分别为0.2%、0.1%、0.5%。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的样品6份，精密称定7.5 g，分别精密加入混合对照品溶液(抗氧剂1010、330、1076、168浓度分别为0.1017、1.012、1.000和1.055 mg/ml)3 ml，按照“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下分析。结果抗氧剂1010、330、1076、168的平均加样回收率分别为82.4%、84.5%、91.6%和95.7%，RSD分别为0.5%、1.1%、1.5%和1.3%。

2.9 检测限和定量限

取混合对照品溶液用二氯甲烷与乙腈(1∶1)逐步稀释，按照“2.1”色谱条件进行测定，记录4种抗氧剂的信噪比，以信噪比为3∶1时的进样浓度作为检测限，以信噪比为10∶1时的进样浓度作为定量限，各抗氧剂的检测限和定量限浓度如表2所示。

表2 4种抗氧剂的检测限与定量限试验结果

2.10 样品含量测定

2.10.1提取试验样品测定结果

取中药袋8批，按照“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下分析，以峰面积计算含量，结果见表3。

表3 中药袋中抗氧剂的含量测定结果 μg/g

2.10.2迁移试验样品测定结果

取中药袋8批，按照“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”色谱条件下分析，以峰面积计算含量，结果见表4。测定结果表明，8批中药袋中均未检出抗氧剂330，检测到抗氧剂1010、1076、168有不同程度的迁移，样品放置7天后抗氧剂的迁移量没有明显增加。

表4 迁移试验样品测定结果 ng/cm2

3 讨论

3.1 检测波长的选择

取抗氧剂1010、330、1076、168对照品适量，加入二氯甲烷和乙腈(1∶1)制成适当浓度的溶液，以二氯甲烷和乙腈(1∶1)为空白，在190～800 nm波长范围内进行光谱扫描，结果表明抗氧剂1010、330、1076、168都在274 nm处有最大吸收，干扰少且稳定。

3.2 提取方法的选择

本实验以甲苯、乙腈∶四氢呋喃(1∶1)、乙腈为溶剂进行提取，以抗氧剂1010、330、1076、168回收的含量分别为指标，观察回流(1、2、5和6 h)、超声(20、30和40 min)不同的提取方法，结果表明乙腈为提取溶剂时，回流5.0 h，抗氧剂1010、330、1076、168含量均达到最高且能提取完全。

3.3 流动相的选择

本实验考察了水-四氢呋喃-乙腈、乙腈-水、乙腈、甲醇为流动相，发现以甲醇为流动相的色谱图基线更平稳，峰型和分离度均较好，所以确定其为流动相。

3.4 迁移试验浸泡液的选择

中药合剂的pH一般为3.5～7.0，又考虑到中药液在放置过程中微生物的滋长易导致酸败现象，所以选择水、pH 3.5缓冲液和pH 8.0缓冲液作为浸泡液模仿灌装和使用。

3.5 迁移试验提取方法的选择

分别用Cleanert PEP-SPE固相萃取小柱吸收提取液，并用乙腈洗脱，收集洗脱液；旋转蒸发仪浓缩提取液近干，用乙腈溶解并定容；用正己烷提取浸泡液，收集正己烷提取液，用氮气吹干，正己烷定容。用3种提取方法对4种抗氧剂做加样回收，发现用旋转蒸发仪浓缩提取液近干，用乙腈溶解并定容回收率最高。

3.6 抗氧剂330的情况分析

本次收集的样品中检测到抗氧剂1010、1076、168，未检测到抗氧剂330。抗氧剂1010、1076、168在不同的提取液有所迁移，所以建议在生产加工中药袋时，选用合格的药品包装材料。这样才能降低抗氧剂带来的风险，保障人民群众用药安全。

综上所述，本实验所建立的HPLC法测定中药袋中4种抗氧剂含量的检测方法，4种抗氧剂在一定浓度范围内呈线性，回收率、精密度和重复性等均达到要求。可满足药包材中抗氧剂1010、330、1076、168的定性与定量分析，为药包材的质量控制提供一定的依据。