牧草在重金属污染土壤治理中的修复和综合利用潜力

姜 娜，杨京民，Gahonzire Bonheur，李 元，祖艳群①

(1.云南农业大学动物科学技术学院,云南 昆明 650201;2.云南农业大学资源与环境学院，云南 昆明 650201)

各类工厂的建立和对矿产资源的开发，人类早期对资源的不合理利用使土壤重金属污染早已成为一个全球性严峻的生态环境污染问题。在此污染情势下，与之前提出的物理、化学等治理方法相比，植物治理以其低成本、治理过程的原位性等特点成为目前广受关注和应用的一种环境友好型措施。植物治理中的应对措施多为利用超富集植物进行土壤修复和金属提取，以及种植低积累植物进行安全生产，规避土壤风险[1]。目前，超富集植物已成为修复重金属污染土壤中屡见不鲜的研究热点，但其具有一定的局限性，多数属于野生草本植物，生长速率和年生物量通常较低，限制了它们对土壤重金属的提取能力[2]。而关于低积累植物的研究目前多集中于人类可直接食用作物上，往往忽略了土壤中存在的重金属元素通过牲畜赖以食用的牧草输送到牲畜体内，从而导致人体健康受到危害的情形。对此，一些学者筛选和研究了经济和生态效益并存的牧草类植物来替代超富集与低积累植物的种植利用。

在植物治理中，牧草类植物大多属于草本植物，生长周期短，适应性较强，易于栽培，生物产量较高，可以刈割多茬，饲喂家畜的成本较低，具有较高的经济生产价值[3]。作为先锋植物，就牧草对逆境的抗性、经济生态效益高的特性来说，用其进行绿色生态治理已受到广大科研人员的一致认可[4-6]。一些研究表明，禾本科杂交狼尾草(Pennisetumamericanum×P.purpureumcv. 23A×N51)、高丹草〔Sorghumbicolor(Linn.)Moench. ×Sorghumsudanense(Piper) Stapf.〕和苏丹草〔Sorghumsudanense(Piper) Stapf.〕对重金属Cd、As吸收能力较强，可作为污灌区重金属Cd、As污染土壤修复植物[7]。豆科植物紫花苜蓿(MedicagosativaLinn.)对多种金属中Cd的吸收系数最大，属于高积累植物，可替代Cd超富集植物对Cd污染土壤进行修复[1,8]。此外，杨姝等[9]对大量苜蓿品种的筛选发现，一些品种可作为农田安全生产的低积累植物进行种植利用。这些研究表明牧草类植物对重金属具有一定耐性，但不同牧草的耐性和积累能力不同，对不同金属胁迫的响应也存在显著差异，可分为高积累牧草和低积累牧草应用于重金属污染地区种植。利用牧草对重金属积累能力的不同，筛选、种植重金属积累差异的品种，已成为治理土壤重金属污染、保障食品安全的有效策略之一[10]。为此，在金属污染土壤治理和综合利用中，牧草的研究现状、对金属的积累与响应机制等相关研究具有重要的理论意义和实践应用价值。

1 牧草对重金属的耐性及积累特征

重金属污染对牧草的生长、产量和品质等均有较大影响。牧草地上部生长直接影响着产量的多少。牧草品质主要取决于蛋白质、矿物质及纤维素含量的多少，蛋白质、矿物质含量越高，纤维素含量越低，牧草的营养价值就越高，反之就越低，而各类氨基酸含量是用于评价牧草饲用价值的重要指标[11]。牧草在刈割后对于家畜重要的营养成分是蛋白质和水溶性碳水化合物，金属与蛋白质的巯基绑定，通过与其他离子产生拮抗或协调作用，抑制酶的活性和蛋白功能，干扰牧草根系对 Ca、Mg、P、K等营养元素的吸收，可溶性糖、纤维素、蛋白质、叶绿素和氨基酸含量发生变化，牧草品质受到影响[12-14]。

优良牧草类植物以禾本科、豆科为主，菊科、莎草科、藜科较少。我国对治理重金属污染土壤具有潜力的优良禾本科和豆科饲用牧草见表1[15-32]。不同牧草的耐性和积累能力不同，对重金属的外在耐性响应多表现在生长势、生物量、品质、产量、株高和根长等形态指标上。多数情况下，地下部分根系形态会最先发生响应，可表现为主根伸长受到抑制，根尖粗短，侧根及根毛数量减少，根毛伸长受限，根系分泌物增加等[33-34]。地上部分生长发育受到影响，生理生化指标以及光合作用发生显著改变[35]。细胞膜透性增大，植物结构蛋白与功能蛋白改变，植物信号传导受到影响，光合速率通常会降低[36]，叶绿素[13]、丙二醛 (MDA)[37]、脯氨酸[38]和可溶性糖[39]含量等均受到重金属胁迫的影响。由于活性氧的增加，牧草体内抗氧化酶系统启动，超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)等生理指标均发生不同程度的变化[40]。一般情况下，SOD、POD和CAT活性在一定浓度范围内随胁迫浓度的增加呈先增加后下降趋势[41]，非酶系统中谷胱甘肽还原酶(GR)活性被改变，谷胱甘肽(GSH)、抗坏血酸(AsA)等会被大量消耗[42]。

2 牧草对重金属耐性及积累差异的影响因素

2.1 不同牧草对重金属的耐性和积累差异

对土壤重金属吸收和积累较强的主要牧草类植物多为禾本科和豆科，这些牧草类植物经济价值高，大多可作为生物质能源植物和污染土壤修复的先锋植物，对Cd、Pb、Zn和Cu等重金属具有较高的耐性和积累能力，但大多为草种中的单一品种。

重金属含量是反映牧草积累能力的重要指标，大多数耐性牧草吸收积累土壤中重金属总量高于土壤中重金属含量，根部重金属含量高于茎叶中重金属含量，常见于高积累植物修复；但不同牧草的茎叶及根系积累量具有差异性，当植株吸收重金属总量较低、茎叶中重金属含量较少时，可作为低积累植物安全生产[43]。不同植物对重金属的耐性、吸收和积累效应不同，这种影响存在种间、种内差异。在不同物种的牧草比较中，黑麦草对Cu的耐受性要高于狼尾草、高丹草和紫花苜蓿，其中，苜蓿耐受性较差[44]，与鱼小军等[32]研究中发现苜蓿对Cu、Cd和Pb的耐受性较差的结果相似，但与韩晓姝等[45]研究的紫花苜蓿对Cd2+耐性较好的结果不同。张丽等[7]在研究10种不同牧草对重金属吸附效果时发现，杂交狼尾草、多年生黑麦草对Cd、As吸收及富集能力高于试验中其他物种，而紫花苜蓿对Cd的吸收能力也较强。这与牧草的品种参照以及不同物种的自身差异性有关。在比较同一种牧草不同品种积累能力时，贾乐等[46]对20个紫花苜蓿品种进行筛选时发现“甘农1号”为耐Cd且高积累品种，而“陕北”为Cd低积累品种，表明同一物种中不同品种对重金属的吸收积累存在明显差异。对此，可将牧草分为低积累型、中等积累型和高积累型，对同一物种不同品种进行分类再做应用研究。

表1 主要牧草类植物对重金属的耐性及积累特征

2.2 不同重金属对牧草的影响

在单一金属胁迫下，杂交狼尾草在供试4种草本植物中虽为非超积累植物，但对As的富集能力较强[47]；MEHARG等[48]研究发现绒毛草(HolcuslanatusLinn.)中抗性品种As的积累速率远低于敏感品种。此外，重金属Cu对紫花苜蓿、黑麦草、狼尾草、高丹草种子萌发及幼苗生长有着不同影响，黑麦草种子对重金属Cu的耐性较强[44]。与单一污染条件相比，在复合污染条件下，牧草中重金属含量更为复杂。黑麦草地上部分Cu含量受土壤中Zn、Si的抑制，但Zn、Si促进了黑麦草根部Cu含量；Zn活性随着土壤中Cu、Si投加量的提高而增大；Cd活性受到Cu、Zn的抑制[49]。土壤环境中同时存在Cd和As复合污染时，As有促进苜蓿吸收Cd的功能[50]；在研究Cd-Zn相互作用时发现适量Zn能够显著降低黑麦草和三叶草中总Cd浓度[51]；此外，在复合污染下品种差异选择方面，杂交狼尾草、高丹草和苏丹草是修复Cd、As复合污染土壤的先锋植物[7]；在评估不同草本缓冲带吸收金属的能力试验中，紫花苜蓿中Cu和Pb含量明显高于黑麦草和印度大麦[52]。

2.3 其他因素

牧草在重金属胁迫下，除受品种、金属元素种类的影响外，还受季节变化、苗龄、温度、光照、供水量、土壤肥力、前期储备碳水化合物管理水平、有机质组成，以及牧草落叶程度和速率等环境因子的影响。据报道，牧草的生长能力受到季节和肥料效应的影响，而金属形态没有因季节变化而发生重大变化[53-54]。一些研究者报道，随着植物成熟度的增加，金属含量会降低；而另一些研究者报道，生长年限更长的草本植物金属含量更高[55]。并且，多数牧草类植物叶片面积较大，蒸腾作用作为矿物质移动的驱动力更有利于蒸腾速率高的叶片积累[56]。此外，压力也会影响牧草叶片的元素含量[54]。

3 牧草对重金属胁迫的响应机制

3.1 牧草对重金属响应的生理机制

3.2 牧草对重金属响应的酶学机制

抗氧化系统和非酶系统是牧草在金属胁迫下做出自我响应的重要机制，能够避免过高浓度活性氧(ROS)对牧草产生的毒害，也是牧草重要的解毒防御系统。多年生黑麦草SOD、POD和CAT活性等在Cd胁迫下呈先升高后降低再升高的响应趋势[60]，与根系内超氧化物酶基因(Mn-sod)、过氧化氢酶基因(Cat)、抗坏血酸过氧化物酶基因(Apx)、谷胱甘肽过氧化物酶基因(Gpx)等表达在抗逆代谢中的作用有一定关系，在持续的重金属胁迫下，Mn-sod、Cat和 Gpx等基因的表达迅速被诱导，ROS对抗氧化酶相关基因均产生了积极影响[61]。

为了在重金属毒性环境中生存，牧草通过体内高度亲和配体与重金属在胞液中发生络合作用来实现重金属解毒机制，主要通过两种类型多肽金属配体——植物螯合肽(phytochelatins， PCs)和金属硫蛋白(metallothioneins，MTs)。重金属与 PCs或 GSH 螯合后，被转运到液泡中进一步解离(图2[62])。LI等[63]将狗牙根〔Cynodondactylon(L.)Pers.〕中 PCs 基因cdPCS1转至烟草中，发现转基因烟草中 PCs 含量是野生型的3.88倍，Cd 积累量增加 3.21 倍。对此，通过改变或表达 PCs 的合成来积累更高水平的 PCs似乎是增强重金属积累能力的一个有效方法。一些研究者通过氨基酸序列分析和进化树分析，发现MsMT1基因与其他植物的1型金属硫蛋白基因具有较高的同源性，MsMT1基因在转基因苜蓿的根和子叶中能够高效表达，增加苜蓿对胁迫的抗性[64]。今后可利用MT上的巯基与牧草中重金属离子结合成无毒或低毒复合物，以增强牧草的耐性。

3.3 牧草对重金属响应的分子机制

金属毒性和抗性分子机制方面的研究大多集中在单子叶作物如小麦、玉米和水稻，以及双子叶作物如拟南芥等，而对牧草类植物的研究较少。目前，有关植物重金属相关转运蛋白的研究中发现了大量重金属响应基因家族，包括ABC载体、YSL蛋白家族、NRAMP基因家族、P 型 ATP酶、ZIP 家族以及上述大量涉及PCs和 MTs 基因的小分子螯合物等，能够在不同重金属胁迫下被激活。如模式植物拟南芥中P 型 ATP酶中HMA 基因亚族能够转运有毒金属穿越细胞膜，HMA3、HMA4、HMA9 等HMA 基因已被证实与 Cd 吸收转运相关[65]。在Al胁迫下，紫花苜蓿ABC转运子跨膜域的基因MsSTAR2能够在根茎叶中大量表达，诱导激活Al对苜蓿的损伤保护机制，是ABC载体中Al胁迫响应的重要基因[66]。在紫云英中，脂质转运蛋白基因nsLTP1 中的2个AsE246、AsIB259仅在低浓度Cd处理下根瘤中高效、特异表达，在茎叶组织中不表达，而在高浓度Cd处理下维持在较低表达水平上，表明重金属胁迫与豆科植物的根瘤发育和固氮功能密切相关，与“低促高抑”的生理响应相吻合，nsLTP1可能影响着根瘤的固氮能力和植株生长[67]。在高羊茅(FestucaelataKeng ex E. Alexeev)中，通过导入紫花苜蓿中Hsp23基因表达载体，MsHsp23在As胁迫下高水平表达，Hsp的积累可以稳定膜蛋白，并较对照植株表现出较低的H2O2含量，MsHsp23可能会增强高羊茅对As胁迫的抗性[68]。

尽管不同的物种可能拥有不同的逆境响应基因和机制，但许多牧草的编码序列与研究颇多的作物有很高的遗传相似性，如目前拥有丰富的遗传和基因组资源的紫花苜蓿与重要的农业豆科植物大豆等有着同源性，可使其成为研究豆科植物铝毒的有效系统[69]。

4 不同牧草在重金属污染土壤中应用效益的评估

现阶段修复植物的选择主要集中于超积累植物、高生物量植物和能源植物。牧草在重金属污染土壤中应用潜力巨大。多数牧草具有较高生物量和生长率，较强的竞争力以及生态适应性，并且一些牧草有利于改变土壤结构，增强肥力，是非常理想的植物修复资源。目前，国内外约有10余种牧草可用于重金属污染土壤修复(结合表1)，主要代表种类有紫花苜蓿、多年生黑麦草、一年生黑麦草、苇状羊茅、杂交狼尾草、高丹草、香根草(Vetiveriazizanioides)、百喜草(PaspalumnotatumFlugge)、狗牙根、柳枝稷(Panicumvirgatum)、荻〔Triarrhenasacchariflora(Maxim.)Nakai〕、芦竹(Arundodonax)等，这些牧草吸收的重金属总量大，对单一或复合重金属污染土壤均能起到一定程度的修复作用[3,47,70-71]。

在重度污染场地中，通常不种植饲用作物，利用一些物理、化学等方法结合高生物量植物进行土地修复和生态恢复。在用于矿区生态恢复的植被中，芒草被公认为是十分具有前景的生物燃料和污染场地植物修复的高生物量能源植物。据报道，3倍奇岗(Miscanthusxgiganteus)这一品种的生物量年产量可高达61 t·hm-2，可用于污染场地种植来实现增加生物质在可再生能源生产中所占份额的生物经济目标[72-73]。ZHANG等[74]研究结果表明，杂交狼尾草对Zn和Cd吸收量虽低于超富集植物对Zn和Cd吸收量标准，但每株杂交狼尾草地上部分吸收Zn、Cd的总量分别为9 039、624 μg，相当于Zn超富集植物东南景天富集的总量，分别是Cd超富集植物天蓝遏蓝菜(Thlaspicaerulescens)和龙葵(Solanumnigrum)吸收Cd量的2.6倍和1.2倍。黑麦草对多种重金属具有较强的耐受性，GHOLINEJAD等[75]研究表明多年生黑麦草具有较强的富集Pb能力，适用于重金属污染(质量含量达1 000 mg·kg-1)的土地上播种。在中度或轻度污染场地中，常常通过选育耐性牧草结合改良剂、农艺措施等进行污染土壤的修复和安全生产。其中，一些对重金属耐受且低累积的牧草十分适用于轻度污染场地的饲用种植利用。杨姝等[9]筛选出的Cd 低累积苜蓿品种“四季旺”和Pb 低累积苜蓿品种“WL525HQ”十分适合轻度污染场地的种植和生产利用。刈割、合理灌溉、调节土壤pH值、施肥以及应用植物种子包衣技术等合理的农艺措施被认为是清洁、低风险、无二次污染的提高植物修复效果的理想途径。LI等[76]研究发现，一些牧草经过2次收割后，地上部分生物量均显著高于单次收割量，生物量平均值从4.1 t·hm-2增加至71.4 t·hm-2，累积的重金属总量也明显提高，如籽粒苋吸收Cd的含量从0.53 g·hm-2增加至0.95 kg·hm-2。改良剂生物炭(BC)配合高磷肥(P)的投入可以提高紫花苜蓿产量，降低Cd浓度，达到牧草安全利用标准的要求[77]；XIAO 等[78]研究还表明施用BC和P肥时，白三叶也是一种适宜在低浓度Cd污染土壤上种植的牧草品种。肥料、钝化剂等与重金属的相互作用可以影响土壤对重金属的吸附解吸过程，改变土壤重金属形态，从而影响作物对重金属的吸收和积累。此外，还有一些微生物联合修复技术，如PGPR菌株(粘性拟青霉)和抗Cu根瘤菌共接种对可生物降解螯合剂(EDDS)在改善苜蓿生长和提高对金属胁迫的耐受性方面具有巨大潜力，增加了放线菌和芽孢杆菌的相对丰度以及土壤养分含量，促进了植物生长，提高了土壤的生化活性，减轻重金属毒性[79]。WU等[80]研究表明，在10～70 μmol·L-1Cd胁迫下，获得的突变菌株“BM18-2”具有更强的耐Cd能力和更强的除Cd能力，对杂交狼尾草中Cd积累和植物生长有促进作用，可作为潜在的Cd污染土壤生物修复菌剂。但目前有关微生物研究多是在实验室使用人工污染土壤进行，实际应用仍存在一定困难，仍需进一步深入研究。

5 小结与展望

如何利用牧草类植物自身的优势有效解决重金属污染现状，是当前研究的热点。目前已发现多种对土壤重金属污染治理具有潜力的牧草类植物，利用高积累高生物量的能源牧草进行污染土壤的修复和重金属提取，联合附加产业，进行产业化推广，可以创造一定的经济价值，形成一条牧草非饲用性修复重金属污染土壤的综合利用技术体系。对低积累品种的筛选和研究，为在轻度污染土壤上种植满足畜牧业发展和安全生产利用的牧草提供了可能，也是一种全新的土壤治理方法。未来仍需扩大对低积累的不同牧草不同品种的筛选和机制研究。关于转基因的抗性牧草育种仍待研发，重金属积累差异品种间的评判指标尚未统一，亟待完善。今后可重点围绕不同积累能力的牧草在重金属胁迫下的差异性研究，进一步探索发现重金属胁迫下牧草相关转运、信号传导等途径的调控及牧草积累特性基因表达的差异，以期为今后提高牧草在重金属污染土壤中净化、修复作用及牧草食品安全等问题提供理论基础和技术支持。