基于宏基因组(metabarcoding)技术的橡胶种植对林下节肢动物多样性的影响

马占霞,张 玲,甘建民,武珊珊,苏建美,尚宇梅,李鑫鑫

(1.滇西应用技术大学普洱茶学院,云南 普洱 665000;2.中国科学院西双版纳热带植物园热带森林生态学重点实验室,云南 勐仑 666303)

位于印度-缅甸生物多样性热点区域的西双版纳,是我国热带森林植被面积最大、类型最多样、保存最完整、生物多样性最丰富的地区,也是具有全球意义的生物多样性关键地区之一[1]。由于处于热带生物区系向亚热带生物区系过渡的生物地理群落交错带上,西双版纳地区生物多样性较为丰富,但生态系统也较为脆弱[2-3]。近几十年来,西双版纳地区大面积的热带雨林逐渐被单一种植的橡胶林替代,橡胶林面积由1976年占全区面积的1.3%扩展到2007年的11.3%[4],2017年西双版纳傣族自治州橡胶种植面积已达50.04万hm2[5-6]。橡胶种植带来了一系列生态问题[7-8],其中最直接的生态效应是生物多样性降低[9-10]。

土地利用变化造成生物多样性丧失的原因主要是:使原有生境消失,从而导致依赖这些生境的物种随之灭绝;改变了原有生境的空间格局,影响物种的扩散、迁移和建群,从而缩小了物种的分布范围,降低个体和种群的存活机会[11-12]。WATT等[13]研究发现,在间伐热带天然林林冠上,蚂蚁物种保留在87%以上,是皆伐林地的20倍。热带森林中甲虫的物种丰富度比橡胶种植园高,且随着森林破碎化程度的增高而减少[14]。不同节肢动物类群对土地利用方式的响应不同,BENG等[15]对西双版纳茶园和橡胶林中节肢动物的调查结果显示,鞘翅目和双翅目与土地利用方式相关,而鳞翅目和蜚蠊目对土地利用没有响应。随着西双版纳地区土地利用过程中干扰强度的加大及橡胶林的扩张,甲虫、蚂蚁等节肢动物物种多样性和群落组成均受到影响[16-19]。目前,西双版纳土地利用方式对生物多样性影响的研究主要侧重于节肢动物的物种多样性和不同土地利用方式下节肢动物多样性的比较分析,然而在单一橡胶林种植背景下,森林镶嵌格局在不同景观尺度上对节肢动物物种分布格局的影响研究还鲜见报道。综上所述,探究具有指示环境变化功能的节肢动物群落对橡胶种植的响应,可为西双版纳生物多样性保护提供数据支撑。

笔者探究热带森林转化为橡胶林后,橡胶林和森林镶嵌景观格局对节肢动物群落组成和物种多样性的影响,分析影响节肢动物分布格局的环境因素,从而探讨森林破碎化产生的生态学效应,为保护区规划提供数据支持。采用野外调查和室内分析相结合方法,探讨西双版纳纳板河流域橡胶林和森林镶嵌格局对节肢动物群落结构和生物多样性的影响,拟回答以下主要科学问题:(1)森林和橡胶林节肢动物群落组成和多样性是否有差异?(2)橡胶林景观背景下森林镶嵌格局导致森林和橡胶林节肢动物群落结构发生变化的主导因素是什么?

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区域位于云南省西双版纳傣族自治州景洪市与勐海县接壤处的纳板河流域国家级自然保护区及其周边森林和橡胶林,总面积为270.1 km2,海拔为800～2 304 m,全区地势西北高东南低,中部为纳板河流域谷地;气候类型属北热带湿润气候区,年降水量为1 100～1 600 mm;保护区按小流域生物圈保护区理念建设,划分核心区、缓冲区和试验区3大功能区。在缓冲区和试验区遍布数个村寨及大面积橡胶林,其中,零星散布着被橡胶林隔断的残余森林片段。

1.2 取样方法

通过实地情况调查并结合使用IKONOS卫星地图[20],选取9个片段森林及其相毗邻的9个橡胶林为取样样地(图1、表1)。节肢动物的获取采用马氏网(长×宽×高为3.5 m×2.0 m×1.5 m)的方法[21]。在所选取的每个样地内分别设置4个马氏网,且两网间距大于100 m,距离林地边缘大于100 m,以避免边缘效应对实验结果的影响。定期收集样品,包括旱季(2014年3—5月)和雨季末(2014年9—11月),每15 d清空1次收集瓶,旱季和雨季各收集6次节肢动物样品。所收集样品均保存在φ=95%的酒精中带回实验室进行分子生物学实验,利用metabarcoding技术鉴定至可操纵的分类单元(operational taxonomic units,OTUs)。

表1 纳板河研究样地基本信息

1.3 样地环境因子的测定

调查过程中,用手持GPS仪(GARMIN 62S)记录相关样点经纬度、海拔、坡度和坡向等样点信息。每个取样点的土地利用和森林覆盖情况,使用分辨率图像(来自DigitalGlobe卫星的ArcGIS 10.5 Baseman图像)进行绘制。在景观尺度上,以样地为中心,分别以500、600、700、800、900和1 000 m为半径画圈,得到6个尺度的覆盖区,并从该区内提取所需要的森林覆盖率指数。对不同景观尺度的森林覆盖率和节肢动物物种多样性做logistic回归分析,结果显示,在以500 m为半径的区域内,节肢动物物种多样性和森林覆盖率的相关性尤为显著(R2=0.75,P=0.001),同时,鞘翅目(R2=0.48,P=0.017)、双翅目(R2=0.62,P=0.004)和膜翅目(R2=0.50,P=0.025)与森林覆盖率的相关性也在该区域内尤为显著。因此,最终确定景观尺度为以500 m为半径的圆。在样方尺度上,变量在半径为50 m的覆盖区内进行评估。选择不同的空间尺度,以覆盖具有不同觅食距离的一些节肢动物的“效应尺度”。景观尺度环境变量包括天然森林覆盖率、取样点到森林距离。橡胶林内的环境变量包括胶树年龄、橡胶树间距、取样点到片段森林边缘距离、海拔、坡度和坡向。森林内的环境变量包括森林面积、树种多样性、取样点到片段森林边缘距离(表1～2)。所有景观变量采用ArcGIS 10.5计算。

表2 景观尺度和样方尺度的解释变量及其描述

1.4 分子实验流程

节肢动物样品参照YU等[3]方法进行挑捡,即从每一只节肢动物上获取组织材料,不同节肢动物取样位置不同,如较小的节肢动物取整只,较大的取前足;如鞘翅目、鳞翅目和蜘蛛目等一般取前足,大小如蚊子大小。用德国QIAGEN公司提供的DNA提取试剂盒(QIAGEN DNeasy Blood & Tissue)对混合样品提取总DNA。利用美国invitrogenQubit 2.0荧光定量仪和QubitdsDNA HS分析试剂盒对基因组DNA精确定量,以确定PCR反应加入的DNA量。PCR选取的引物和反应体系参照YU等[3]的实验。PCR产物定量混合后制备文库,用美国Illumina公司提供的建库试剂盒,按照建库说明书建立文库,并用北京索莱宝科技有限公司提供的2×SYBRGreen qpcr 试剂盒对文库进行绝对定量。等浓度混合文库后,按照说明书,使用MiSeq ReagentKit v3(Illumina,nc.,2015)进行测序。用Soapbarcode[22]流程对所得序列进行分析,包括降噪、嵌合体识别、OTU挑选和分类归属鉴定等。

1.5 统计分析

利用配对F检验分析片段森林和橡胶林中节肢动物物种多样性差异(R软件包vegan)。对不同土地利用方式节肢动物物种组成进行维恩图(Venn diagram)分析(R软件包VennDiagram),并对节肢动物物种组成进行稀疏曲线分析和制图(R软件包vegan和elasticnet包)。为了探究森林和橡胶林中节肢动物群落组成,对节肢动物群落组成结构差异性进行分析:用bray相异性指数度量森林之间和橡胶林之间节肢动物群落的beta多样性(R软件包vegan),并做非度量多维尺度法(nonmetric multidimensional scaling,NMDS)和差异性检验(R软件包vegan和cluster),用胁强系数(stress,S)衡量NMDS分析结果的优劣。通常认为当S<0.2时,可用NMDS的二维点图表示,其图形有一定的解释意义;当S<0.1时,可认为是一个好的排序;当S<0.05时,认为具有很好的代表性。为了确定不同景观尺度下每个变量对响应变量的影响,在R软件包中挖掘1组预测变量,对候选模型(广义线性模型,GLM)进行方差分析,选出最优模型(R软件包lme4)。然后对最佳候选模型进行多模型推理(R软件包MuMIn),采用赤池信息准则(AIC，CAI)比较不同模型的拟合优度,其中,AIC的截止阈值(ΔwAIC,ΔCwAI)<2[23],并对最佳模型集进行平均化。

2 结果与分析

2.1 橡胶林和森林林下节肢动物群落组成和alpha多样性

在片段森林中采集节肢动物共14 451个个体,隶属于27个类群。其中,优势类群包括弹尾目(Collembola)、鳞翅目(Lepidoptera)、蜱螨目(Acarina)和双翅目(Diptera),4者个体数之和占总个体数的70.22%;常见类群包括膜翅目(Hymenoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、啮目(Psocoptera)、蜘蛛目(Araneae)、同翅目(Homoptera)、等翅目(Isoptera)、缨翅目(Physopoda)和直翅目(Orthoptera),占总个体数的26.42%;其余稀有类群有15目,占总个体数的3.36%。橡胶林中采集到节肢动物10 754个个体,隶属于24个类群。其中,优势类群包括蜱螨目、鳞翅目、双翅目和膜翅目,占总个体数的71%;常见类群包括弹尾目、鞘翅目、啮目、直翅目和蜘蛛目,占总个体数的24.69%;其余稀有类群有15目,占总个体数的4.31%。橡胶林和森林中节肢动物群落物种组成的稀疏曲线见图2,森林中节肢动物alpha多样性(OTUs)明显高于橡胶林。在森林和橡胶林中共得到397个OTUs,其中,片段森林中有347个,橡胶林中有136个。片段森林和橡胶林中共有OTUs为86个,片段森林节肢动物特有OTUs为261个,占物种总数的65.74%,橡胶林中节肢动物特有OTUs为50个,占物种总数的12.59%。森林节肢动物群落组成中,鞘翅目(F=12.01,P=0.003)、双翅目(F=12.43,P=0.003)、鳞翅目(F=7.365,P=0.015)和膜翅目(F=20.98,P<0.001)均显著高于橡胶林(图3)。

2.2 橡胶林和森林林下节肢动物群落beta多样性

单因素方差分析结果表明,林型对节肢动物的beta多样性(bray相异性指数)有显著影响(F=4.47,P=0.038),森林之间、橡胶林之间beta多样性平均值分别为0.760和0.706。NMDS分析结果(图4)表明,片段森林和橡胶林中节肢动物物种组成存在差异。胁强系数(stress)为0.19,表明前两个维度解释了高百分比的排序。

2.3 森林和橡胶林镶嵌景观对林下节肢动物多样性影响的因素分析

用广义线性模型对节肢动物物种多样性和不同尺度下的环境解释变量做回归分析,在所得到的模型中选择ΔCwAI<2的模型,所选模型中的环境解释变量为在该尺度下对节肢动物多样性有影响的环境因子。在景观尺度(表3)上,最优模型1环境解释变量为森林覆盖率和到森林距离;优化模型2环境解释变量为森林覆盖率。模型预测结果表明,节肢动物物种多样性与森林覆盖率的增加有关。在样方尺度上,橡胶林中的多模型分析(表3)表明模型6最优,其环境解释变量包括胶树年龄和到森林边缘距离。对于片段森林中节肢动物物种(表3)而言,模型8最优,其环境解释变量包括片段森林面积、树种多样性、到森林边缘距离、坡向和海拔。

表3 影响节肢动物物种多样性(OTUs)的优化模型

3 讨论

3.1 森林和橡胶林对节肢动物物种多样性和beta多样性的影响

在西双版纳纳板河自然保护区,橡胶林种植导致的橡胶林和森林镶嵌性格局中,节肢动物群落物种多样性和群落结构因土地利用方式的改变而变化。森林中节肢动物的多度和物种丰富度均显著高于与之相毗邻的橡胶林。这一结果与其他关于土地利用变化对节肢动物影响的研究结果一致,表明将自然林转变为人工林会降低节肢动物物种多样性。森林虽然在结构上已经被破坏,但是其相对于环境单一、异质性低的橡胶林,拥有更丰富的食物资源和更适宜的环境,利于对环境要求高的生物类群生存[24]。MENG等[17]对纳板河流域甲虫的调查结果显示,橡胶林中甲虫多度和物种多样性显著低于自然林;也有研究表明橡胶林步行虫物种丰富度比森林低,原因可能是活动能力强的昆虫会选择较适宜的生境[25]。

对节肢动物beta多样性的研究结果表明森林中节肢动物与橡胶林中具有显著差异,森林中的物种更替速率快于橡胶林。尽管由于取样量的问题,在森林和橡胶林中节肢动物取样量均未达到可以对其进行全面调查的程度,但是通过采样量外推后,两种生境中节肢动物物种丰富度依然表现为森林显著高于橡胶林,这说明对于节肢动物群落分布,森林生境更加异质化。HOUSTON等[26]研究发现,白蚁群落组成受植被类型的影响,植被类型相似性越高,其中的白蚁群落组成相似性就越高。LIU等[19]对西双版纳地区蚂蚁的研究结果也表明,橡胶林环境的同质性导致橡胶林中蚂蚁beta多样性较低,即蚂蚁的群落组成比较相似。在纳板河地区,各个片段森林因地理因素和植被类型不同,生境异质性较高且存有丰富的节肢动物物种多样性。另一方面,在自然林向橡胶林转变的过程中,环境受到很大破坏,较为单一的橡胶林生境只能保存对生境质量要求不高的类群,所以橡胶林中节肢动物物种的beta多样性较低。

值得注意的是,即使橡胶林中节肢动物物种数量和物种多样性均小于森林,但橡胶林之间节肢动物物种组成也存在差异,当采样量加大时,橡胶林中也会发现更多的节肢动物物种。这可能是由不同橡胶林样地的不同管理方式所致,如杀虫剂的使用与否,施肥量的不同以及刈割的频率与程度不同等,使不同的橡胶林样地所受干扰程度有所差异。另外,也可能是由于橡胶林的林龄不同,纳板河流域大多数橡胶林都是低龄林,随着橡胶林龄的增长,栖息地的生存环境质量会下降,这对某些昆虫物种极为不利,尤其对专性昆虫和稀有种的影响更大。

3.2 橡胶林和森林镶嵌格局中影响节肢动物多样性的主要环境变量

在景观尺度上,研究显示节肢动物物种多样性与森林覆盖率显著相关。当森林覆盖率大于50%时,节肢动物物种多样性大幅度增加。可能的原因是在森林覆盖率大于50%的区域内,景观受人类活动的干扰较小,基质连通性高,且植物物种资源丰富,可以容纳更多的生物种群。

在样方尺度上,地形因子坡向和海拔对森林节肢动物群落组成有不同程度的影响。海拔、坡向和坡度等地形因子影响光照、温湿度和养分等的空间分布,对生物多样性也会产生影响[27-28]。其中,海拔影响着森林土壤、植被、小气候以及树木的生长和分布等,对昆虫的生长、发育、存活和生殖力产生影响,进而影响昆虫群落的组成、结构和功能[29];因橡胶的种植有人为因素的影响,多数橡胶林坡向向阳,所以笔者研究所调查的森林和橡胶林之间存在一定的海拔、坡度和坡向差异,给分析节肢动物群落的分布格局带来一定影响。

在橡胶林中样方尺度上,橡胶林林龄和到森林边缘距离对节肢动物物种多样性产生显著影响。林龄小于20 a的橡胶林(低龄林)具有开放式林冠,郁闭度较低,而林龄在20～40 a(高龄林)的橡胶林具有较密闭的林冠层,郁闭度相对较高。研究发现,低龄橡胶林中食蚜蝇的物种丰富度提高,而野蜂物种多样性下降[17];步甲在低龄橡胶林中的个体数量虽与森林中相似,但在高龄橡胶林中的数量下降,这些都说明随着胶树年龄的变化,节肢动物的群落组成也会有差别[30]。在森林中样方尺度上,片段森林面积、树种多样性和样点到森林边缘距离是影响节肢动物多样性的主要环境变量。有关种-面积曲线的研究结果表明,与小片段岛屿相比,大片段岛屿可容纳更多的物种数,这是因为更大面积的生境具有更高的环境异质性,因此生物类群的数量和组成均显著优于小片段生境,较高的生境异质性在提高物种多样性的同时,也为更多的特有种生存提供了可能[31-32]。小面积片段森林受生存资源不足、边缘效应即样点到森林边缘距离和树种多样性较低等因素的影响,生存环境稳定性减弱,可能易导致物种间的竞争加强,促使动物群落中优势物种过度繁殖,从而可能导致小片段森林中节肢动物优势种群所占比例比大片段森林要高,但物种丰富度降低。

4 结论

(1)以橡胶林为背景的土地利用景观格局中,橡胶种植选址应充分考虑周边森林的树种多样性,适当保留向阳坡向的森林片段,提高森林与橡胶林镶嵌格局的异质性,将有利于节肢动物多样性的保护。

(2)在500 m研究尺度上,当森林覆盖率大于50%时,节肢动物物种多样性显著增加,即在该尺度上,森林覆盖率至少要维持在50%以上,才能更好地保护节肢动物多样性。

(3)随着胶龄的增加,开展多层次、多物种的人工橡胶林群落构建模式,包括橡胶与茶、咖啡、可可、大叶千斤拔,甚至多物种混合的复合混农林体系,丰富树种多样性将有利于保护鸟类、土壤动物和昆虫等群落的物种多样性。