依泽麦布抑制膀胱癌细胞增殖、迁移及其机制

熊康平，彭天辰，熊垚祎，肖 宇，鞠林高，王 刚，王行环

(武汉大学中南医院泌尿外科，湖北武汉 430071)

膀胱癌是世界上第10大常见癌症，2018年有近20万人死于膀胱癌，占所有癌症死亡人数的2.1%[1]。我们急需寻找新的更高效的膀胱癌治疗药物。肿瘤代谢重编程中肿瘤细胞能改变其新陈代谢方式，课题组前期运用膀胱癌组织及正常膀胱上皮组织进行转录组学检测分析，发现脂类代谢与膀胱癌关系密切[2]。胆固醇平衡紊乱是许多疾病如癌症的发病基础[3-4]。此外，更有报道称细胞内胆固醇的合成与膀胱癌化疗耐药相关[5]。辛伐他汀能通过抑制羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-COA)还原酶来抑制内源性胆固醇的合成，从而降低血胆固醇水平。课题组前期使用辛伐他汀来抑制胆固醇的合成，发现辛伐他汀能有效抑制膀胱癌细胞的增殖与迁移，并诱导膀胱癌细胞在G0/G1期阻滞[6]。除抑制内生合成外，外源吸收的减少也能降低血胆固醇水平。依泽麦布(Ezetimibe)能抑制外源胆固醇的吸收，被用于高胆固醇血症的治疗。有研究认为，依泽麦布与辛伐他汀的合用在降低血胆固醇的同时增加了癌症的患病率[7]，也有研究称不能证明依泽麦布会对癌症发生率产生不利影响[8-9]。甚至一些研究发现依泽麦布能有效抑制肿瘤的发展[10]。本研究采用两种细胞系，探究依泽麦布对T24和5637细胞增殖、迁移的抑制及其原理。

1 材料与方法

1.1 细胞培养膀胱癌细胞系T24和5637来自于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，细胞系均经由中国典型培养物保藏中心认证。T24和5637置于含5%CO2的37 ℃细胞培养箱中，使用含有10%(体积分数)胎牛血清(Gibco，中国)，1%(体积分数)的青霉素与链霉素的RPMI-1640培养基(Gibco，中国)培养。

1.2 细胞增殖实验采用噻唑兰(MTT)法进行细胞增殖实验。首先，向96孔板中的每个孔中加入100 μL含有3 000个膀胱癌细胞的RPMI-1640培养基，放入细胞培养箱中培养24 h；再用不同浓度的依泽麦布(0、5、10、20、40、60、80、100 mmol/L)分别处理48 h；然后，向每孔中添加20 μL (5 mg/mL)MTT，于细胞培养箱37 ℃培养，4 h后移去孔内培养基，加入150 μL DMSO以溶解蓝紫色甲瓒沉淀。最后用酶标仪 (Cat.#Spectra Max M2，Molecular Devices，USA)在波长490 nm处测量其吸光度值(A)，结果以相对细胞增殖率显示，相对细胞增殖率=A(经依泽麦布处理组)/A(未经依泽麦布处理组)，实验重复3次。

1.3 细胞划痕实验设置不添加依泽麦布的对照组，加入低浓度依泽麦布(20 mmol/L)与高浓度依泽麦布(40 mmol/L)的实验组。T24和5637膀胱癌细胞接种于6孔板中，待其长满后，用无菌枪头刮一平整笔直的划痕，并标记一固定位点，用PBS冲洗后，于6孔板中加入不同浓度的依泽麦布(0、20、40 mmol/L)，分别于0 h和24 h，用相差显微镜在标记位点拍照，计算其迁移率后进行统计学分析。迁移率=24 h后细胞边缘移动距离/初始细胞边缘距离，实验重复3次。

1.4 细胞周期测定T24和5637细胞在含有不同浓度依泽麦布(0、20、40 mmol/L)的培养基内培养48 h，胰酶消化后离心收集。用含有碘化丙啶和破膜剂的1xDNA染色剂(Multi sciences，China)重悬细胞，于黑暗环境中37 ℃培育30 min。用流式细胞仪 (Beckman，Cat.#FC500)分析其各组细胞周期分布状况。每次分析1×105个细胞，实验重复3次。

1.5 蛋白质分离与免疫印迹分析胰酶消化经不同浓度依泽麦布(0、20、40 mmol/L)处理的膀胱癌细胞后，离心收集，于冰上加入含有磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液(Sigma-Aldrich，USA)裂解细胞30 min。以12 000 r/min、4 ℃离心15 min，收集上清液，并加入5×蛋白上样缓冲液，100 ℃加热变性10 min，于-20 ℃冻存备用。用7.5%～12.5%SDS-PAGE凝胶电泳进行变性与分离蛋白，用湿转法将蛋白转移到PVDF膜上(Millipore，USA)，再以5%脱脂牛奶(BD Biosciences，USA)封闭1 h，与一抗孵育过夜，TBST洗膜，再与二抗孵育2 h。条带使用增强化学发光试剂盒显示(Bio-Rad，USA)，由分子成像仪Chemi Doc XRS +成像系统显影记录。

1.6 统计学分析所有的实验均至少重复3次，采用单因素方差分析(ANOVA)和双尾Student’st检验来评估各个亚组间是否具有统计学意义，所有数据均采用SPSS 16.0进行统计分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 依泽麦布抑制膀胱癌细胞增殖T24和5637经过不同浓度依泽麦布(0、5、10、20、40、60、80、100 mmol/L)处理48 h后，细胞的增殖能力明显受到抑制，并且呈现出浓度依赖性(P<0.05，图1)。

图1 依泽麦布对细胞增殖的影响

2.2 依泽麦布抑制膀胱癌细胞迁移应用划痕实验在不同浓度依泽麦布(0、20、40 mmol/L)处理2种膀胱癌细胞24 h后，测量其迁移率，发现两种浓度的药物均能显著抑制细胞的迁移能力，高浓度的依泽麦布对其迁移率影响更大(P<0.05，图2)。

2.3 依泽麦布影响膀胱癌细胞周期通过流式细胞术发现依泽麦布能影响膀胱癌细胞的周期分布，结果显示高浓度依泽麦布(40 mmol/L)使T24和5637的细胞周期在 G0/G1被显著阻滞，而在低浓度时(20 mmol/L)，与对照组相比，也可诱导细胞周期在G0/G1期被阻滞(P<0.05，图3)。

2.4 依泽麦布影响膀胱癌细胞表型相关蛋白表达水平用Western blot分析参与上皮-间质转化(EMT)过程与细胞G0/G1周期相关的蛋白质，包括β-连接素(β-catenin)、波形蛋白(vimentin)、CDK2、CDK4，WB结果显示两种膀胱癌细胞系在低、高浓度的依泽麦布组中的CDK2、CDK4、β-catenin及vimentin的表达均呈剂量依赖性下降(P<0.05，图4)。

A、C：不同浓度依折麦布处理5637、T24细胞的伤口愈合实验;B、D：不同浓度依折麦布处理5637、T24细胞后迁移率统计；**P<0.01，*P<0.05

A：流式细胞术分析细胞周期；B：依折麦布处理5637、T24细胞后G0/G1期、S期、G2/M占比分析，*P<0.05。图3 依泽麦布对细胞周期的影响

图4 依泽麦布对细胞蛋白表达的影响

3 讨 论

流行病学报道称，高胆固醇饮食与包括膀胱癌在内的多种癌症有关，会提高多种癌症的发生风险[11]。依泽麦布作为降低血胆固醇水平的药物被使用。有生物学家与临床医生担心其是否会导致癌症的发病率升高。与担忧相反，有报道称依泽麦布能抑制肿瘤血管的生成[10]。我们的研究发现，依泽麦布能有效抑制膀胱癌细胞的增殖与迁移，并阻滞其细胞周期在G0/G1期。

通过MTT法发现对两种膀胱癌细胞系使用不同浓度依泽麦布处理48 h，能抑制其增殖，且呈剂量依赖性。流式细胞术的结果也显示依泽麦布使细胞被阻滞在G0/G1期，参与G0/G1期调控的蛋白(CDK4、CDK6)在药物的处理下，其蛋白丰度也有不同程度的下降。CDK4/6是细胞周期从G1期进入S期的关键调控因子[12]。而CDK4/6表达下降将阻碍细胞周期进入S期，从而使细胞周期发生阻滞，最终影响细胞增殖。由此我们推论，依泽麦布能阻滞膀胱癌细胞周期在G0/G1期，从而抑制膀胱癌细胞的增殖。

依泽麦布可能通过抑制上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)来抑制细胞的迁移能力。划痕实验提示依泽麦布能抑制膀胱癌细胞的迁移，免疫印迹分析的结果也证实依泽麦布下调了EMT相关蛋白β-catenin及Vimentin的表达。EMT过程与肿瘤的侵袭和转移密切相关，近年来，波形蛋白被认为是EMT的标记物[13]，波形蛋白也可作为早期诊断膀胱移行细胞癌的重要指标。β-catenin是细胞粘附连接不可或缺的结构成分，在癌症进展相关的转变中，β-catenin的激活可以通过增强转录对EMT进展产生影响[14]。可见，依泽麦布可能是通过影响EMT来抑制膀胱癌细胞的迁移能力的。

综上所述，依泽麦布能有效遏制膀胱癌细胞的增殖与迁移，阻滞其细胞周期在G0/G1期，可能成为一种新型的膀胱癌治疗药物。