微量法测定土壤酶活性的实验步骤

葛永翠

（兰州中大司法鉴定所，甘肃 兰州 730030）

1.微量法测定土壤β-葡萄糖苷酶活性

1.1 实验的意义

土壤β-葡萄糖苷酶（S-β-GC）能够催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖，是纤维素分解酶系中重要的组成成分之一，在土壤微生物的糖类代谢方面具有重要的生理功能。

1.2 实验原理

S-β-GC能够催化对-硝基苯-β-D吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚，后者在400nm有特征光吸收。

1.3 实验所要的耗材

烘箱、研钵、白纸、自封袋、30-50目筛子、万分之一电子天平、称量纸、药匙、离心管、离心管板、移液器10ul100ul200ul、移液枪头10ul200ul、96孔板、振荡器、离心机、水浴锅、酶标仪：S-β-GC试剂盒、蒸馏水、甲苯

1.4 实验步骤

土样的前处理，将新鲜的土样放在37°烘箱中烘干待用；用研钵研磨并过30～50目筛子，仔细收集过筛的土样即为风干的土样，装进自封袋并用记号笔编上编号，方便做样和处理数据；

称取0.02g风干土样分别于1.5ml的离心管中，一个是对照管，一个是测定管，并作三平行；

给对照管和测定管各加入10ul的甲苯，震荡混匀15分钟，加入试剂盒里面的试剂三各160ul,其中测定管在加入试剂盒里面的试剂二130ul，对照管加入130ul的蒸馏水是体系达到平衡，反应总体积都是300ul；

37°控温振荡器里面催化反应一小时，一定迅速拿出来，结束催化反应，使得到的数据更佳准确；

将离心管放入90°水浴锅中煮沸5min，注意放入前一定压紧离心管的盖子，以免沸水浴的时候会崩开盖子，使其水分蒸发，影响实验结果，最好把水浴锅的盖子不要盖紧，留一个开口，盖子崩开的几率就会变小；

取出离心管迅速冷水冷却，擦拭后放入常温离心机里离心，设置转速为10000g，离心10min,取其上清液70ul于96孔板中，加入试剂盒中的试剂四130ul，充分混匀，注意：混匀的时候96孔板在桌面来回轻轻摇晃，避免洒出导致实验结果的准确性；

静置2min后，将96孔板放入酶标仪曹里，调节酶标仪在400nm处，读取吸光度数据，并保存；

根据公式计算其活性；y=225*(△A+0.0027)，△A为测定管吸光度-对照管吸光度（结果见表1）。

2.土壤纤维素酶的活性（S-CL）

2.1 实验的意义

土壤纤维素酶活性来源于土壤微生物，土壤纤维素酶催化农作物秸秆产生的葡萄糖是主要的碳源营养物质。

2.2 实验的原理

采用蒽酮比色法测定S-CL催化纤维素降解产生的还原糖的含量。

2.3 实验所要的耗材

烘箱、研钵、白纸、30-50目筛子、自封袋、电子天平（万分之一）、称量纸、药匙、离心管、离心管板、移液器100ul200ul1000ul、移液枪头200ul1000ul、96孔板、振荡器、恒温培养箱、离心机、水浴锅、酶标仪、土壤纤维素酶（S-CL）试剂盒、蒸馏水、浓硫酸、甲苯。

2.4 实验步骤

土样前处理与土样β-葡糖糖苷酶的步骤中的1一样；

称取土样0.05g分别置于1.5ml的离心管中，每一个测定管设置一个对照管，分别编号如tr1和tr-1，并作三平性；

分别加入甲苯50ul，振荡混匀15min；给测定管加入试剂二90ul,试剂三370ul,蒸馏水90ul,对照管加入试剂三370ul,蒸馏水180ul,使得体系是600ul；

放入37°控温振荡器中，催化反应3小时，反应结束立即取出放入90°水浴锅煮沸15min；在转移到8000g,常温离心机里离心10min,移取上清液140ul于96孔板中，加入终止液260ul,轻轻混匀；

放入酶标仪曹里，设置波长为620nm,检测其吸光度，并用公式：y=38.3*(△A+0.0462)，△A同上，计算出纤维素酶活性；得到的数据见表1中。

3.土壤脲酶活性检测

3.1 实验意义

土壤脲酶能够水解尿素，产生氨和碳酸；土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效氮含量成正相关；土壤脲酶活性反应了土壤的氮素状况。

3.2 实验原理

利用靛酚蓝比色法测定脲酶水解尿素产生的NH3-N。

3.3 实验耗材

研钵、白纸、筛子、自封袋、烘箱、电子天平（万分之一）、称量纸、药匙、离心管、离心管板、振荡器、水浴锅、浮漂、移液器20ul、移液器100ul、移液器200ul、移液器1000ul、枪头200ul、枪头1000u、离心机、96孔板、计时器、培养箱、酶标仪、甲苯、土壤脲酶试剂盒、蒸馏水。

3.4 实验步骤

称取风干土样0.05g于1.5ml离心管中，每一个测定管设置一个对照管，并编号为tr1和tr-1，做三平行；

分别都加入甲苯20ul，其中测定管加入试剂90ul,试剂三190ul,对照管里依次加入蒸馏水90ul,试剂三190ul；

37°水浴锅催化反应24小时，下午2点放入，次日下午2点取出，迅速常温离心，设置为10000g，10min，取其上清液于并稀释10倍；

移取稀释后的上清液80ul于96孔板中，轻轻混动，切勿洒出；

静置2min后加90ul蒸馏水，放入酶标仪槽里，设置波长578nm,得到吸光值，根据公式：y=1312*(△A-0.0373)，△A同上，计算出脲酶活性，数据在表一中。

4.实验数据

土壤酶活性（单位） 样品编号 测定管 对照管 计算公式 结果B1 0.8714 0.6878 41.9175 B2 0.9977 0.8099 42.8625 B3 0.9921 0.8018 43.4250 β-葡萄糖苷酶(umol/d/g)y=225*(△ A+0.0027)C1 0.9002 0.1598 922.4672 C2 0.8854 0.1428 925.3536 C3 0.8527 0.1093 926.4032脲酶(ug/d/g)y=1312*(△ A-0.0373)51.7318 D2 2.1221 0.8117 51.9578 D3 2.0645 0.7757 51.1305 D1 1.8963 0.5918纤维素酶（(mg/d/g)）y=38.3*(△ A+0.0462)

通过吸光度计算其活性，得到这份土壤的β-葡萄糖苷酶活性、脲酶活性和维素活性的三个指标，其平均数分别是42.7333umol/d/g、924.7413ug/d/g、51.6067mg/d/g，同理也可以用微量检测土壤的酶含量，研究土壤酶含量和活性，能帮助我们定性定量地改变土壤，提高其利用率。