多角度分析P.ostreatus改性对玉米秸厌氧消化产气性能的影响

黄文博，袁海荣，李秀金

（北京化工大学 环境科学与工程系，北京100029）

0 引言

以玉米秸为原料，通过厌氧消化技术生产甲烷是一种高效的可再生能源生产方式[1]。玉米秸的纤维素和半纤维素含量达55.0%～75.0%，具有很高的甲烷转化潜力[2]。由木质素、纤维素和半纤维素的复杂交联结构形成的生物质抗降解屏障具有一定的疏水作用，阻碍了厌氧微生物对纤维素和半纤维素的利用，尤其是影响水解阶段纤维素酶和木聚糖酶在秸秆上的吸附和反应[2]。为提高玉米秸的厌氧消化性能，须对其进行改性处理。

白腐菌能通过木质素氧化酶系统对木质素进行高效降解，提高秸秆的可利用性[3]。P.ostreatus是可食用白腐菌，除了对木质素具有高效降解性外，对纤维素和半纤维素也具有降解能力，以提供自身生长所需的营养。刘红菊研究了P.ostreatus对麦秸木质纤维素的降解效果，结果显示，预处理10 d的麦秸木质素含量降低43.8%，纤维素含量提高37.2%[4]。Mustafa使用P.ostreatus预处理稻草20 d，木质素降解率为33.4%，纤维素与半纤维素的降解率分别只为7.9%和16.9%[5]。由此可见，P.ostreatus能够明显降解秸秆中的木质素，对纤维素和半纤维素的降解程度较低，提高了它们的可利用性。以往研究表明，经P.ostreatus改性后的木质纤维类底物的乙醇和甲烷转化率均有所提高。Worfa研究了不同P.ostreatus改性时间对木薯乙醇产率的影响，结果显示，改性1周的木薯可发酵糖得率最高为34.1g/L，乙醇产率较对照组提高35.0%左右[6]。Kainthola对P.ostreatus改性5周的稻草进行厌氧消化，甲烷产率提高至对照组的1.6倍[7]。

P.ostreatus的生长过程分为菌丝生长、原基形成和子实体分化3个阶段。P.ostreatus在不同生长阶段中，对木质纤维素的降解能力不同，因此，经过不同P.ostreatus改性时间的玉米秸的酶水解性和甲烷产率也有明显差异[8]。Worfa将P.ostreatus对木薯的改性时间由1周延长至2～8周，木薯发酵糖转化率降低[6]。已有研究认为，延长白腐菌改性时间，使纤维素和半纤维素的消耗增加是影响乙醇或甲烷转化的主要原因[6]。近期研究发现，菌丝穿透可以提高秸秆的孔隙度和表面积，从而提高改性秸秆的酶吸附性和反应性，但随着白腐菌生长时间的延长，菌丝蛋白在秸秆表面的附着又会阻碍酶对秸秆的接触[9]。因此，须要对不同P.ostreatus改性时间的玉米秸的酶吸附、酶水解和甲烷转化进行多角度分析，研究各因素间的关联性，通过机理分析，确定最佳的改性时间。

本文采用P.ostreatus对玉米秸进行45 d改性试验，通过动力学模型拟合，量化改性参数，对不同改性时间的玉米秸的木质纤维素降解、酶吸附、酶水解和甲烷转化性能的变化进行多视角综合分析，探究提高玉米秸厌氧消化产气性能的最佳条件。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用菌种P.ostreatus购自黑龙江省科学院微生物研究所。玉米秸取自北京市延庆区，将其风干粉碎至20目备用。接种物为北京顺义区某中温沼气站消化残余物，发酵原料为猪粪。原料和接种物基本性质示于表1。

表1 玉米秸及接种物基本性质Table 1 Characteristics of corn stover and inoculum

1.2 实验方法

（1）P.ostreatus改性

将360 g（以TS计）玉米秸置于17 cm×33 cm×5 cm的聚丙烯塑料薄膜袋中；以玉米秸∶石膏=99∶1配比混合均匀；用纯水调节至含水率为65%，pH值为6～7；121℃高压蒸汽灭菌1 h。灭菌原料接种P.ostreatus，接种量（W菌种/W原料）为10%。将接种后的玉米秸置于恒温培养箱中，在温度为28℃、湿度为85%～90%条件下进行45 d改性处理。

在45 d改性周期中，每间隔5 d取样，测定玉米秸对纤维素酶和木聚糖酶的吸附性和水解性。通过动力学分析，表征改性玉米秸对纤维素酶和木聚糖酶的可及性和反应性。每个取样时间点做3组平行实验。

（2）厌氧消化

以不同改性时间的玉米秸为试验组，以未改性的玉米秸为对照组，只添加接种物为空白组，进行甲烷潜力（BMP）测定。反应器工作体积300 mL，顶空体积200mL（图1）。玉米秸有机负荷为4 g/L（以VS计），接种污泥有机负荷为8 g/L（以VS计），pH为7.0±0.2。在35±2℃下厌氧消化45 d。实验组、对照组及空白组均设3组重复。

图1 甲烷潜力测定实验装置Fig.1 Schematic diagram of BMP test device

1.3 分析方法

（1）基本性质测定

根据APHA测定总固体含量（TS）及挥发性固体含量（VS）[10]。采用元素分析仪测定有机元素含量（TC，TH，TO及TN）。采用pH计测定pH值。采用全自动纤维分析仪测定木质纤维素含量。采用排水法测定厌氧消化过程产气量（标况下计算）。采用气相色谱测定所得气体组分含量。

（2）酶吸附性能测定

纤维素酶吸附性能的测定方法：在柠檬酸钠缓冲溶液（0.05M，pH 4.8）中加入2.5%改性玉米秸，纤维素酶浓度为10 FPU/g，在4℃条件下反应2 h。反应结束后，将样品以4 000 r/min离心15min，采用Bradford法测定反应前后上清液中蛋白质含量的变化[11]。根据公式（1）计算纤维素酶吸附率。采用相同方法测定木聚糖酶，木聚糖酶添加量为20 IU/g。

式中：A为初始酶添加量，mg；B为上清液中未吸附酶量，mg。

（3）酶水解性能分析

参照文献[8]，[12]所用的方法对改性玉米秸的纤维素酶及木聚糖酶水解率进行测定。根据式（2），（3）计算酶水解率：

通过Nidetzky和Ohmine动力学模型，分析改性玉米秸对纤维素酶和木聚糖酶的反应性以及反应速率的影响，如式（4）和（5）所示[13]。

式中：Y为不同水解时间的纤维素酶或木聚糖酶水解率，%；t为水解时间，h；P为玉米秸初始纤维素或半纤维素含量，%；K为达到最大纤维素或半纤维素水解量一半所需时间，h。

（4）厌氧消化动力学分析

利用BMP甲烷产率可拟合分析一级动力学厌氧消化产气性能，拟合方程如式（6）所示[14]。

式中：BMP（t）为以VS计甲烷产率，mL/g；BMPmax为最大产甲烷潜力（以VS计），mL/g；k为以VS计的甲烷转化速率常数，mL/（g·d）；θ为延滞期，d。

玉米秸有机组分采用概化分子式CnHaOb表示[14]。理论甲烷产量是当底物完全转化成甲烷时的最大体积（标况）。玉米秸的理论甲烷产量和生物降解性可由式（7）和式（8）得到。

式中：BD为生物降解性，%；BMP0为理论甲烷产率（以VS计），mL/g；BMPexp为实验所得甲烷产率（以VS计），mL/g。

2 结果与讨论

2.1 改性玉米秸对纤维素酶和木聚糖酶吸附性能的影响

图2给出了改性玉米秸纤维素酶、木聚糖酶吸附曲线、木质纤维素降解率及降解拟合曲线。

图2 改性玉米秸纤维素酶、木聚糖酶吸附曲线、木质纤维素降解率及降解拟合曲线Fig.2 Enzymes adsorption capacity，degradation ratio and liner fit for lignocellulose of the corn stovermodified by P.ostreatus

图2（a）为不同改性时间的玉米秸对纤维素酶和木聚糖酶吸附率的变化。结果显示，改性5～25 d的玉米秸对两种酶的吸附率随着改性时间的延长而上升。改性25～35 d的玉米秸对纤维素酶的吸附率仍随时间的延长而上升，但改性35～45 d上升趋势停止，对木聚糖酶吸附率随时间延长而降低。经过25 d改性后，玉米秸对纤维素酶的吸附率提高19.3%。改性45 d后，玉米秸对纤维素酶的吸附率提高42.5%。这表明P.ostreatus改性能够明显提高玉米秸对纤维素酶的吸附率。文献[15]的研究表明，纤维素酶是通过与秸秆纤维疏水基团结合而附着在纤维表面，木质素和半纤维素均含有疏水基团，能够吸附纤维素酶，干扰纤维素对纤维素酶的吸附。因此，须要结合改性玉米秸木质纤维素降解情况，进一步分析改性玉米秸对纤维素酶吸附的有效性。

图2（b）为不同改性时间下P.ostreatus对玉米秸的木质纤维素降解率。由图2（b）可以看出，木质素和半纤维素降解率始终高于纤维素。玉米秸初始木质素和半纤维素含量低于纤维素，随着改性时间延长，木质素和半纤维素不断减少，对纤维素酶的吸附减少，因此，纤维素对纤维素酶特异性吸附提高。改性30 d后，纤维素降解率达到20.5%，改性玉米秸的纤维素含量较低，对纤维素酶的吸附无法进一步提高。

木聚糖是半纤维素的主要组成部分，木聚糖酶的吸附性能对半纤维素的降解效果具有主要影响。由图2（a）可以看出，改性25 d的玉米秸对木聚糖酶吸附率提高21.0%，但改性时间超过30 d后吸附率降低了43.6%，表示部分吸附的木聚糖酶发生脱附，但残余木聚糖酶继续催化半纤维素水解，半纤维素降解率持续提高。

对不同阶段半纤维素降解速率进行线性拟合，如图2（c）所示。如图2（c）所示，改性处理30 d后，半纤维素降解速率降低，表明木聚糖酶吸附性降低对半纤维素的降解产生了影响。此外，Noori和Karimi研究认为，木聚糖是维持秸秆持水性的主要物质，而酶的吸附与秸秆持水性相关[15]。因此，随着半纤维素的降解，木聚糖酶的吸附性也受到影响。综上所述，改性25 d的玉米秸对纤维素酶和木聚糖酶的吸附效果最佳。

2.2 改性玉米秸对纤维素酶和木聚糖酶水解性能的影响

酶水解性可以定量分析不同改性时间的玉米秸中纤维素和半纤维素对纤维素酶和木聚糖酶的可及性和反应性。图3所示为改性玉米秸纤维素酶水解二级反应模型拟合曲线及动力学参数。图中c-0，c-5，c-10，c-15，c-20，c-25，c-30，c-1 flush，c-2 flush分别表示经P.ostreatus改性0，5，10，15，20，25，30，35，45 d的玉米秸。

图3 改性玉米秸纤维素酶水解二级反应模型拟合曲线及动力学参数Fig.3 Nidetzky and Ohminemodel and kinetics parameter of cellulase hydrolysis of corn stovermodified by P.ostreatus

不同改性时间的玉米秸在不同水解时间下的纤维素酶水解率如图3所示。由图3（a），（c）可以看出，0～24 h改性玉米秸秆的纤维素酶水解率快速上升，120 h后水解达到平衡。对不同改性时间玉米秸的纤维素酶水解率分析结果表明，改性5～45 d的玉米秸纤维素酶水解率先上升后降低。其中，改性25 d的玉米秸纤维素酶水解率最高，较对照组提高12.9%。这可能是因为在改性前25 d，玉米秸对纤维素酶的吸附率提高明显，促进了对纤维素的水解。改性35～45 d的玉米秸秆对纤维素酶吸附率的提高趋于停止；在此阶段玉米秸的纤维素含量相较初始含量降低了36.0%，纤维素酶可催化水解反应的纤维素减少，导致最终纤维素水解率比对照组降低了2.3%。

Nidetzky纤维素酶水解模型拟合曲线如图3（a）所示，拟合获得的纤维素酶反应动力学参数P如图3（b）所示。P值表示底物对纤维素酶的反应性，K值表示达到最大纤维素水解率一半时的水解时间。随着改性时间的延长，玉米秸P值先增大后减小。改性25 d的玉米秸P值最大，为33.0%，较对照组提高18.7%，表明改性25 d的玉米秸对纤维素酶的反应性最高。改性45 d的玉米秸P值与对照组差异不显著（p＞0.05），表明延长改性时间使玉米秸的水解性能降低。K值随改性时间的延长也呈先上升后下降趋势，且改性玉米秸K值是对照组K值的1.9～3.3倍，表明改性玉米秸对纤维素酶的反应速率的影响更小，水解反应更稳定。

图3（c）为Ohmine纤维素酶水解模型拟合曲线，图3（d）为拟合获得的纤维素酶反应动力学参数酶水解反应初始速率ν0和酶在秸秆上的失活速率k。结果显示，改性5～25 d的玉米秸秆ν0低于对照组，改性30～45 d的玉米秸秆ν0与对照组相近，表明纤维素酶在改性玉米秸上的初始反应速率降低。改性玉米秸的k值随改性时间的延长先降低后增高，改性25 d的玉米秸k值最小，为0.16，表明在水解过程中，纤维素酶在改性25 d的玉米秸上失活速率最低，水解持续时间最长。

采用相同模型对木聚糖酶水解率进行拟合的结果如图4所示。图4中c-0，c-5，c-10，c-15，c-20，c-25，c-30，c-1flush，c-2flush分别表示经P.ostreatus改性0，5，10，15，20，25，30，35，45 d的玉米秸。结果显示，水解120 h后木聚糖酶水解率仍在上升，表明半纤维素水解达到平衡所需的理论时间更长。改性25 d的玉米秸木聚糖酶水解率最高，较对照组提高75.3%。

图4 改性玉米秸木聚糖酶水解二级反应模型拟合曲线及动力学参数Fig.4 Nidetzky and Ohminemodel and kinetics parameter of xylanase hydrolysis of corn stovermodified by P.ostreatus

Nidetzky木聚糖酶水解模型拟合结果显示，改性时间延长，玉米秸的P值先增大后降低，改性30 d玉米秸P值最大，较对照组提高24%。改性玉米秸K值较对照组也有不同程度增大，改性玉米秸对木聚糖酶的水解反应也更加稳定。Ohmine模型拟合结果显示，木聚糖酶在改性玉米秸上的初始反应速率ν0低于对照组，尤其在改性时间大于30 d时，ν0明显降低，这是由于改性玉米秸对木聚糖酶吸附率降低导致的。改性玉米秸k值随改性时间延长先减小后增加，改性25 d和30 d时k值最小，木聚糖酶在这两组改性秸秆上失活速率最低，水解持续时间最长。

综合纤维素酶和木聚糖酶的两组模型拟合结果表明，P.ostreatus改性会降低玉米秸对纤维素酶和木聚糖酶的初始反应速率，但玉米秸的反应性提高，纤维素酶和木聚糖酶在玉米秸上的有效反应时间延长，有利于甲烷转化，25 d是最佳改性时间。

2.3 P.ostreatus改性对玉米秸厌氧消化产气性能的影响

通过BMP试验分析P.ostreatus改性对玉米秸厌氧发酵甲烷产率、甲烷转化速率和生物降解消化性能的影响（表2）。改性25 d的玉米秸甲烷产率最大，为272mL/g，较对照组提高16.7%。8组改性时间中，改性35 d的玉米秸甲烷产率较对照组降低约1.3%，改性45 d的玉米秸甲烷产率降低12.4%。通过一级动力学拟合计算初始甲烷转化速率和生物降解性的结果显示，改性25 d的玉米秸初始甲烷转化速率较对照组提高19.0%，生物降解性提高19.7%。改性45 d的玉米秸甲烷转化速率降低4.8%，生物降解性降低6.6%。由此表明，改性25 d的玉米秸厌氧消化性能最佳，改性45 d的玉米秸厌氧消化性能最差。

表2 不同改性时间玉米秸甲烷产率、生物降解率及动力学参数Table 2 Biomethane yield，BD%and kinetic parameters of the corn stovermodified for different time

通过对改性玉米秸酶吸附、酶水解和厌氧消化性能进行多角度分析结果表明，改性25 d后，玉米秸对纤维素酶和木聚糖酶吸附率提升，进而在酶水解过程中反应性提高，失活率降低，酶水解效率提高。尽管酶初始反应速率在改性25 d的玉米秸上降低，但水解过程更稳定，促进了玉米秸厌氧消化水解阶段的正向进行，提高了初始阶段甲烷转化速率。此外，改性25 d的玉米秸生物降解性上升，表明玉米秸可利用性提高，微生物对其中的木质纤维素利用更充分，总甲烷产率提高。改性时间超过30 d时，玉米秸酶吸附和酶水解性能下降，使初始甲烷转化速率降低。另外，此阶段玉米秸的纤维素和半纤维素已被菌丝体大量消耗，生物降解性下降，导致甲烷产率降低。

3 结论

P.ostreatus改性会改变玉米秸对纤维素酶和木聚糖酶的吸附和水解性，影响玉米秸厌氧消化甲烷产率。改性25 d的玉米秸纤维素酶和木聚糖酶吸附率分别提高42.5%和21.0%，纤维素酶和木聚糖酶水解率分别提高12.9%和75.3%，甲烷产率提高16.7%，甲烷转化速率提高19.0%，生物降解性提高19.7%，最佳改性时间为25 d。