实时荧光定量PCR在B族链球菌产前检查中的可行性分析

宦 宇，蔡徐山，齐结华，张春利，乐江漫

上海市嘉定区妇幼保健院检验科，上海 201821

B族链球菌(GBS)也被称为无乳链球菌，是一种革兰阳性链球菌。孕产妇、新生儿等为高危易感人群，孕妇出现GBS感染往往会使胎儿发生宫内窘迫、早产等，造成不良的妊娠结局并引发侵袭性疾病。GBS主要通过羊水或经产道分娩传播给新生儿，引起新生儿感染，导致新生儿发病甚至死亡[1]。目前，临床上多采用普通细菌培养法对孕妇生殖道GBS进行检测，普通细菌培养是GBS检测的金标准，但具有耗时长、灵敏度低、影响因素多等缺点；优点在于可以进行药敏试验，临床可以根据药敏试验结果采用个性化药物治疗。基于此，本研究旨在探讨实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)在孕晚期GBS感染检测中的应用价值，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年7月至2020年2月到本院产前检查，孕周为34～37周，年龄17～44岁的孕晚期孕妇共2 012例的阴道-肛周分泌物标本进行普通细菌培养及实时荧光定量PCR检测。仅取阴道分泌物或仅取肛周分泌物的孕妇未纳入统计。

1.2标本采集 由医生取材，用无菌拭子在孕妇阴道下1/3处旋转取分泌物；另一根拭子在肛周旋转取分泌物。2份标本均需带有上皮细胞。室温保存，2 h内送检。

1.3材料与仪器 上海科玛嘉微生物技术有限公司的哥伦比亚血琼脂平板；法国生物梅里埃公司的ATB全自动细菌分析仪；北京博尔诚公司的B族链球菌核酸检测试剂盒；美国赛默飞公司的ABI 7500 实时荧光定量PCR仪。

1.4分析方法

1.4.1普通细菌培养及药敏试验 1 241例标本采用普通细菌培养检测，将标本接种于哥伦比亚血琼脂平板，5% CO2培养箱内培养18～24 h后，观察菌落形态，挑取可疑菌落在血平板上进行纯培养，然后涂片、革兰染色并镜检。革兰阳性链球菌且触酶试验阴性的做 CAMP 试验，同时用生物梅里埃公司ATB全自动细菌分析仪鉴定细菌，CAMP 试验和仪器鉴定均符合者判定为GBS。对普通细菌培养检出阳性者用生物梅里埃公司的链球菌药敏板条进行GBS药敏试验，操作步骤严格参照厂家说明书执行。

1.4.2实时荧光定量PCR 828例采用实时荧光定量PCR检测，DNA的提取方法和扩增条件及分析方法严格参照博尔诚公司GBS核酸检测试剂盒说明书操作。其中有57例用上述两种方法同时检测。阴道或肛周分泌物之一检测出GBS即判定为GBS感染。

1.4.3不同菌液浓度对实时荧光定量PCR检测的判定 取普通细菌培养GBS阳性0.5麦氏单位菌落(约为1.5×108cfu/mL)，10倍梯度稀释，直到103cfu/mL，取107、106、105、104、103cfu/mL 5种浓度梯度，同批次进行检测，每种浓度梯度4个重复，Ct值≤38，且有明显S型扩增曲线即判为阳性。

1.5统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析处理。计数资料以例数或百分率表示，采用χ2检验进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1两种检测方法结果比较 1 241例普通细菌培养检测标本中阳性45例，检出率为3.6%，828例实时荧光定量PCR检测标本中阳性79例，检出率为9.5%，两种方法阳性检出率比较，差异有统计学意义(χ2=30.841,P<0.05)。既用普通细菌培养又用实时荧光定量PCR检测的57例标本中，3例实时荧光定量PCR阳性，而这3例中，有1例普通细菌培养阴性，即普通细菌培养只检出2例阳性。

2.2药敏试验 对普通细菌培养检出阳性的45例标本进行药敏试验，结果显示，GBS对青霉素、万古霉素、头孢噻肟、利奈唑胺均100%敏感，对喹奴普汀/达福普汀、氯霉素、左氧氟沙星、克林霉素、红霉素、四环素的敏感率依次降低。见表1。

表1 45株GBS的药敏试验结果(%)

2.3采样部位对实时荧光定量PCR检测结果的影响 对实时荧光定量PCR检出阳性的79例标本进行分析发现，有26例阴道-肛周分泌物均检出GBS，剩余53例仅检出一种分泌物阳性的孕妇中，12例为阴道分泌物阳性，41例为肛周分泌物阳性。也就是说阴道分泌物阳性检出率为4.6%(38/828)，占总阳性人数的48.1%(38/79)；肛周分泌物阳性检出率为8.1%(67/828)，占总阳性人数的87.3%(69/79)；肛周分泌物阳性检出率明显高于阴道分泌物，差异有统计学意义(P<0.05)。而阴道和肛周分泌物联合检测的阳性检出率为9.5%(79/828)，占总阳性人数的100.0%(79/79)。可见阴道和肛周分泌物同时采样可大大提高GBS的检出率，阴道、肛周及阴道和肛周检出率之间比较，差异有统计学意义(χ2=15.647,P<0.05)。

2.4GBS浓度对实时荧光定量PCR检测的影响 对0.5麦氏单位GBS菌落梯度稀释后检测发现，除103cfu/mL菌液的实时荧光定量PCR检测结果的Ct值>38外，其他浓度的Ct值均小于38，见图1。也就是说，实时荧光定量PCR检测GBS的Ct值随菌液浓度降低而升高，可以检测到菌液浓度最低是104cfu/mL。

图1 不同浓度菌悬液PCR检测的Ct值比较

3 讨 论

GBS是条件致病菌，可正常寄居于人体的消化道与泌尿生殖道内。2010年版美国疾控中心《围产期GBS疾病预防指南》规定：在妊娠第35～37周取孕妇直肠阴道分泌物进行GBS检测，并对阳性和高危孕妇采用分娩期预防性抗菌药物进行干预。而在我国，中华医学会起草的2011 版、2018 版《孕前和孕期保健指南》规定：均将GBS收纳为备查项目。

本科室前期采用普通细菌培养检测发现，GBS是本院检出的仅次于粪肠球菌的第2大革兰阳性致病菌[2]。世界各地区妊娠期妇女GBS检出率不尽相同，澳大利亚检出率约为12.0%[3]；西班牙当地妊娠期妇女为10.5%，而移民到西班牙的外国妊娠期妇女的检出率为18.9%[4]；国内文献报道，南京地区的检出率为3.65%[5]，北京地区为8.0%[6]，成都地区为7.6%[7]，广西地区为10.7%[8]，贵州地区为12.6%[9]。本研究采用实时荧光定量PCR检测GBS的检出率为9.5%，这种差异可能与种族、饮食生活习惯、地区及检测手段有关。

普通细菌培养是检测GBS的金标准，其成本低，易开展，因此是国内外大多数医院采用的首选检测方法，但普通细菌培养的缺点是培养周期长，灵敏度略低，且易受比如标本的及时转运接种、阴道或肛门周围杂菌、检测人员的经验等外界条件的影响，导致出现假阴性和假阳性结果。本研究发现，普通细菌培养GBS的检出率为3.6%，而实时荧光定量PCR的检出率为9.5%，后者检出率明显高于前者，差异有统计学意义(P<0.05)。实时荧光定量PCR是对GBS的特定DNA序列进行扩增检测，其优点是操作简便，灵敏度和特异度高，受外界条件影响小，检测时间短，且可以全程观测扩增过程；缺点是不能进行药敏试验指导临床个性化用药。本研究药敏试验结果显示，GBS 对青霉素、万古霉素、头孢噻肟、利奈唑胺100%敏感，与大部分研究结果一致[10-13]。实时荧光定量PCR尽管有不能进行药敏试验的弊端，但因GBS对青霉素和头孢噻肟100%敏感，故可对实时荧光定量PCR检出阳性的孕妇使用青霉素治疗，对青霉素过敏者，可用头孢噻肟治疗，对青霉素和头孢噻肟均过敏者建议补充普通细菌培养及药敏试验，给予个性化药物治疗。

GBS寄居在人体多个部位，本研究发现，仅阴道分泌物标本GBS阳性检出率为4.6%，仅肛周分泌物标本的阳性检出率为8.1%，而阴道-肛周分泌物标本联合检测的检出率为9.5%。这一结果提示，针对GBS的检测，建议送检阴道-肛周双部位分泌物以提高检出率。

常规拭子标本送检，从采样、送检到上机，这个过程可能要经过1～2 d，有时为了能集中检测，标本等待上机的时间可能会更长。这些过程中由于细菌的死亡降解，GBS-DNA必然会损失，造成检测假阴性发生。本研究对菌液浓度稀释后的检测结果提示，当菌液浓度为103cfu/mL时，检测结果为阴性，根据菌液浓度和检测结果的趋势规律，有理由判断：当菌液浓度低于103cfu/mL时，检测结果均为阴性。张静华等[14]研究发现，增菌培养可以提高GBS的检出率。所以，引入增菌步骤是下一步研究的方向。

杨春年等[15]通过6种GBS检测方法的经济学分析发现，从成本-效果分析的角度看，实时荧光定量PCR的性价比最高。

综上所述，采用实时荧光定量PCR检测可以提高GBS的阳性检出率，缩短检测时间，该方法在GBS产前检查中具有可行性，但应注意多部位采样并保证有足够的采集量，以减少假阴性发生。