高毒力肺炎克雷伯菌的血清荚膜分型菌株特点及耐药性分析

雷亚利，潘俊均，修宁宁，邓沛汶，张碧瑜，隋 洪

东莞康华医院检验科，广东东莞 523000

肺炎克雷伯菌隶属于肠杆菌科克雷伯菌属，是一种无动力、无芽孢、有荚膜、能够发酵乳糖的粗短革兰阴性杆菌，是继大肠埃希菌之后临床分离率最高的致病菌。肺炎克雷伯菌是一种条件致病菌，寄居于人体呼吸道和肠道，通常情况下对人体不会致病，当人体免疫力下降时，通过呼吸道侵入肺部引起肺炎甚至肺脓肿，且出现胸腔积液等并发症，或者长期使用抗菌药物导致菌群失调时才会致病。肺炎克雷伯菌对外界环境具有较强的抵抗力，对多数抗菌药物易产生耐药性。1958年在我国台湾地区出现了引起多个部位脓肿，尤其是肝脓肿的高毒力肺炎克雷伯菌(HvKP)，之后在亚洲地区也常有报道[1]。HvKP在平板上经培养后常常出现黏液型菌落，故又称为高黏液型肺炎克雷伯菌。HvKP和普通肺炎克雷伯菌(cKP)的不同之处在于前者不仅引起免疫力低下人群的感染，甚至还会引起健康人全身多个部位的感染，从感染部位蔓延到非感染部位，即形成“远处转移”，一旦HvKP形成耐药，后果不堪设想。因此，鉴别肺炎克雷伯菌是否具有高毒力，不仅有助于临床经验性选择抗菌药物，便于个体化治疗，而且对预防和控制HvKP引起的感染性暴发流行和院内感染有重要意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2016年1月至2019年1月本院各种临床标本中分离出的592株肺炎克雷伯菌。同一患者的标本应来源于不同的感染部位，同一患者的同一部位反复感染标本认定为同一个标本。

1.2试剂与仪器

1.2.1仪器 VITEK 2 compact 全自动细菌鉴定仪、Viia 7型PCR扩增仪、DYY-6D型电泳仪、电泳槽和凝胶成像系统、HR003型DNA提取仪。

1.2.2试剂 GN鉴定卡、AST-GN13和AST-GN334药敏卡及配套生长培养基、dNTP、TaqDNA聚合酶、1.0×PCR缓冲液、DNA标准带、引物。

1.3方法和步骤

1.3.1菌株的分离培养 取材接种于血平板，经37 ℃培养18～24 h后，观察血平板上菌落的生长情况，当有足够单个纯菌落时，下一步进行高黏液型菌株的初步筛选；当菌落密集无法观察到单个菌落时，挑取少量菌再接种于血平板37 ℃培养18～24 h再次观察；当单个菌落过少无法检测时，尽可能挑取多的菌在血平板上增菌，37 ℃培养18～24 h再次观察。

1.3.2高黏液型肺炎克雷伯菌的初步筛选 菌株分离培养后，用接种环轻轻触及肺炎克雷伯菌菌落并往上提拉，重复2次，若观察到黏液丝形成并且长度大于5 mm，即可初步判断为高黏液型表型阳性，初步筛选该菌株为高黏液型菌株，冻存于-80 ℃冰箱。

1.3.3PCR检测血清荚膜分型 将初步筛选的HvKP送往深圳华大基因有限公司检测，采用多重PCR技术扩增HvKP的荚膜血清型基因型(主要是K1、K57、K54、K20、K2和K5型)，根据参考文献[2]设计引物，引物由上海生工生物有限公司合成，各引物相关信息见表1。

表1 荚膜血清型基因引物序列表

1.3.4药敏试验 采用VITEK 2 compact全自动细菌鉴定仪进行药敏试验，抗菌药物有阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、头孢呋辛、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、头孢西丁、亚胺培南、厄他培南、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、环丙沙星、左氧氟沙星、复方磺胺甲噁唑、替加环素。对产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的菌株，采用双纸片扩散法进行确证试验(试剂为Oxoid公司赠品)，判定标准按美国临床和实验室标准协会2016版要求进行。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922(阴性对照)，肺炎克雷伯菌ATCC 700603(阳性对照)。

1.4统计学处理 采用SPSS19.0统计软件进行数据分析处理。耐药监测数据由WHONET5.6导出统计。计数资料以例数或百分率表示，采用χ2检验进行比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1菌株来源 从临床标本中分离出的592株肺炎克雷伯菌菌株来源见表2。

表2 592株肺炎克雷伯菌菌株标本构成比[n(%)]

2.2HvKP菌株的荚膜血清型 从临床分离的78株HvKP中经多重PCR鉴定的血清荚膜分型主要以K1、K2型为主，分别为36株(46.2%)和22株(28.2%)，有11株(14.1%)菌株未鉴定出分型，其他荚膜分型分别为K57型4株(5.1%)、K20型3株(3.8%)、K5型1株(1.3%)、K54型1株(1.3%)。

2.3药敏试验 药敏试验结果显示，592株肺炎克雷伯菌有127株产ESBLs，具有多重耐药性，具体的HvKP和cKP对不同抗菌药物的耐药率见表3。592株肺炎克雷伯菌检测出127株多重耐药菌株，其中78株HvKP中检出多重耐药菌株9株，占11.5%(9/78)；而514株cKP中检出多重耐药菌株118株，占23.0%(118/514)。HvKP对多数抗菌药物的耐药率明显低于cKP。碳青霉烯类药物亚胺培南和厄他培南对肺炎克雷伯菌有明显的抑菌效果，HvKP和cKP对替加环素非常敏感，对其他抗菌药物则表现出不同程度的耐药。总的来说，HvKP对抗菌药物的敏感性要比cKP好，K1、K2血清型肺炎克雷伯菌的黏液表型与黏液表型调节基因A(rmpA)密切相关，K1、K2血清型菌株多与rmpA共存。K1、K2血清型菌株是血流感染和肝脓肿的重要致病菌，在其他脓肿、尿路感染、菌血症中比较常见，K1型菌株多见于肝脓肿，K1和K2型比率在其他感染中相近，黏液型菌株产ESBLs率及对多数抗菌药的耐药率低于非黏液型肺炎克雷伯菌。但值得注意的是，HvKP已出现多重耐药菌株，并且耐药趋势有所上升。

表3 HvKP和cKP对临床常用抗菌药物的耐药率比较(%)

3 讨 论

细菌的致病性不仅取决于其毒力的强弱，还与入侵部位、机体的免疫力强弱及侵入机体的细菌数量多少密切相关。细菌的毒力主要表现在2个方面：一是病原体突破宿主屏障侵入机体的能力，称为侵袭力；二是病原菌产生的毒素。侵袭力包括黏附素、侵袭性物质和荚膜等。肺炎克雷伯菌的致病性主要是其本身的荚膜结构所造成的。因为荚膜具有抵抗吞噬细胞吞噬能力和抵抗有害物质的损伤作用，并且分泌一层黏性物质附着于菌体形成保护作用，使细菌彼此间粘连，也可黏附于组织或细胞表面引起感染，有利于发挥致病作用。荚膜的成分因不同菌种而异，主要是葡萄糖与葡萄糖醛酸组成的聚合物，也可含多肽与脂质。肺炎克雷伯菌的荚膜结构成分主要是多糖，包括荚膜多糖(K抗原)和脂多糖(O抗原)等。根据K抗原至少可将其分成82个血清型[3]。而在血清荚膜分型中，造成人和动物严重侵袭性感染最为密切相关的血清荚膜分型主要是K1、K2和K5血清型[4]。

78株HvKP经多重PCR测定分型后得出K1和K2型分别为36株(46.2%)和22株(28.2%)，有11例未鉴定出分型，未能鉴定出分型的可能原因是目前的引物未能完全匹配或可能存在新的分型，这与殷红莲等[5]的报道较一致。有研究显示，K1、K2是HvKP主要的血清荚膜分型，rmpA是位于180～220 kb大小的毒力质粒上控制生成胞外荚膜多糖的毒力基因之一，而K1和K2血清型菌株上大部分存在rmpA[6]。由于荚膜多糖(K抗原)是肺炎克雷伯菌最主要的毒力因子之一，具有抗吞噬、抗干燥及抵抗有害物质损伤的作用，因此，K1、K2血清荚膜型的HvKP比其他类型菌株毒力更强。由于目前多重PCR鉴别毒力血清荚膜型需要较长时间和较多成本，未来需要有更好的方法鉴别HvKP以缩短鉴定时间，获得更好的治疗效果。

本研究选用的18种抗菌药物中，HvKP对多数抗菌药的耐药率均低于cKP，HvKP仅对磺胺类药物复方磺胺甲噁唑的耐药率达到20.6%，与cKP对复方磺胺甲噁唑的耐药率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。HvKP对其他抗菌药物的耐药率均在20.0%以下，可见HvKP目前对大多数抗菌药物的敏感性还是较好的，容易造成药物敏感株易治疗的假象，但是由于其具有的高毒力性质，常导致宿主病情进展恶化等。HvKP常见的临床表现有：(1)易感人群及易感因素，与cKP比较，HvKP可感染既往健康且年轻的社区居民，故HvKP血流感染和肝脓肿多见于医院门诊就诊者，男性多于女性。(2)转移并发症，HvKP具有侵袭性，容易转移至其他部位引起新的感染。转移可造成各种严重的肝外脓肿，骨、关节、肌肉、筋膜、皮肤软组织、胸膜、前列腺、肾脏及脾脏均可受累，眼、脑膜、中枢神经系统和肺是最常见的转移部位。(3)辅助诊断特点，实验室病原学诊断方法可筛查出相应的病原体并进行相关分型，同时超声和CT检查用于临床诊断HvKP肝脓肿效果较明显。

本院目前累积的病例显示，在血流感染和肝脓肿等疾病分离出HvKP的患者病情恶化迅速、凶险，严重影响临床治疗和预后判断。HvKP产ESBLs率低于cKP，造成这种差异的原因仍然不明确，有可能是因为耐药基因在转变为高毒力菌株时丢失或者HvKP菌株不能获得药物耐药质粒[7],这种推论尚需进一步研究证实。同时，HvKP对碳青霉烯类药物，如亚胺培南和厄他培南及四环素类药物替加环素全部敏感，对β-内酰胺酶抑制药物头孢哌酮/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸和哌拉西林/他唑巴坦的敏感性较好，临床用药可以优先考虑。但由于近年来抗菌药物的滥用，造成耐药率不断上升，尽管目前HvKP对抗菌药物的耐药率还比较低，但因其具有的高毒力性，在临床治疗上还是不容乐观[8-15]。虽然有些药敏试验结果显示肺炎克雷伯菌对所有抗菌药物全都敏感，但未考虑其可能具有的高毒力性，可能会误导临床上进行单种敏感药物治疗而影响治疗效果和病情的预后及转归。

目前对已鉴定为HvKP的菌株一般给予三联用药或者考虑选择新药头孢他啶/阿维巴坦，有较好的治疗效果。因此，精确鉴别HvKP菌株，对临床选择合适的抗菌药物治疗有重要意义。