脐带血造血干细胞-196 ℃保存20年后质量分析

雒 猛，王 忠，高 峰，王 凯，赵清刚

山东省脐带血造血干细胞库，山东济南 250102

脐带血干细胞的应用，已从当初的移植治疗血液病逐步向治疗多种疾病方向发展，脐带血来源的干细胞对治疗早产儿脑损伤和神经后遗症、失代偿期酒精性肝硬化、自身免疫性疾病、黏多糖病和1型糖尿病等均有很好的疗效[1-8]。脐带血自采集到应用有相当一段时间的间隔，把获得的干细胞储存于液氮中，是目前通用的方式。干细胞在液氮中可以保存几个月至十多年仍有很高的细胞活性[9-13]。本研究对-196 ℃储存的20年脐带血200份进行检测，并进行质量分析。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 设备：流式细胞仪(美国BD calibur)、全自动血液分析仪(日本希森美康XN-350)、液氮罐(美国THERMO)、二氧化碳培养箱(美国THERMO)、BacT/ALERT 3D 240全自动血液培养系统(法国梅里埃)、全自动酶免分析仪(奥斯邦STAR+FAME)。试剂：美国BD公司生产的CD34、CD45、mouse IgG、甲基纤维素(加拿大Stemcell)、台盼蓝(德国Sigma)、培养瓶 BacT/ALERT的需氧瓶和厌氧瓶(法国梅里埃)。

1.2标本处理 选取2000年储存已满20年的血液200例，入库前传染病等各项检测指标符合入库标准，标本一直冻存于液氮中。从液氮罐中取出标本，在37 ℃水浴中迅速2 min内复融，标本进行后续检测。

1.3传染病检测 -20 ℃保存标本，取出当时保留的母血、脐带血复检标本，采用酶联免疫吸附试验，采用全自动酶免分析系统分别检测母血、脐带血血浆的乙肝表面抗原(HBsAg)、丙肝病毒抗体(抗-HCV)、梅毒螺旋体抗体(抗-TP)、人类免疫缺陷病毒抗体(抗-HIV)(1+2)和巨细胞病毒(CMV)-IgM抗体。

1.4有核细胞数(TNC) 复苏后的脐带血标本采用全自动血液分析仪获取TNC。TNC的平均回收率为复苏后的TNC均值/冻存前TNC均值×100%。

1.5细胞活力检测 采用台盼蓝拒染法检测细胞的活性，取50 μL脐带血标本与等体积的台盼蓝溶液混匀后，立即取混合悬液镜检，计算其细胞活性。

1.6粒-单核细胞集落形成单位(CFU-GM) 采用甲基纤维素半固体培养液，以细胞浓度为5×105/mL吸取20 μL接种于48孔培养板中，每份标本设置3孔，培养板放置于37 ℃、5%CO2培养箱中，培养14 d后倒置显微镜观察，以大于40个细胞组成的细胞团确认为一个集落，3孔取均值为标本的集落数。

1.7CD34+数值计算 标记流式进样管，设置同型对照，阴性管加入20 μL的CD45-FITC和Mouse-IgG1-PE，阳性管加入20 μL的CD45-FITC、CD34-PE，在阴、阳管中分别加入100 μL标本，室温避光孵育15 min后，加入溶血素室温反应10 min，以2 500 r/min离心5 min，弃上清液，加入500 μL PBS重悬，上机检测。根据流式细胞仪圈门法计算CD34+比值(CD34数目与CD45数目比值)，利用TNC与CD34+比值相乘，计算获得CD34+数值。

1.8细菌/真菌培养 采用全自动血培养系统对复苏的脐带血标本分别进行需氧/真菌和厌氧菌培养，培养周期为5 d。

2 结 果

2.1传染病检测结果 按照脐带血造血干细胞库技术规范要求(试行)，对入库脐带血对应的母血进行HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP和CMV-IgM抗体检测，200份标本母血传染病结果均无反应性。同时按照规范和本库的要求，出库的标本需要同时进行母血、脐带血的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP和CMV-IgM抗体检测，检测结果均为无反应性。200份复苏后脐带血分别接种于需氧/真菌、厌氧培养瓶中进行5 d的培养，结果均和入库的检测结果一致，脐带血无菌生长。见表1。

表1 冻存前与复苏后母血、脐带血传染病及微生物检测结果

2.2TNC 入库前检测200份脐带血的TNC为(11.2±4.8)×108，冻存20年复苏后的TNC为(10.1±4.0)×108，TNC的平均回收率为90.18%，二者差异有统计学意义(P<0.05)；入库前检测200份脐带血的活性为(99.5±1.3)%，复苏后脐带血的活性为(75.4±2.4)%，细胞活性比率为75.78%，二者差异有统计学意义(P<0.05)；入库前检测200份脐带血的CFU-GM为(1.9±0.8)×106，复苏后的CFU-GM为(1.4±0.6)×106，CFU-GM的比率为73.68%，二者差异有统计学意义(P<0.05)；入库前检测200份脐带血的CD34+为(3.1±2.3)×106，复苏后的CD34+为(2.4±2.1)×106，CD34+的比率为77.42%，二者差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液，过去是作为医疗废物来处理。脐带血移植已经成为继骨髓移植和外周血干细胞移植后的一种重要的造血干细胞来源。脐带血干细胞资源丰富，可变废为宝，对供者(母婴)无任何不良影响，病毒感染风险低，人类白细胞抗原组织配型相合要求低，移植后发生排斥反应的危险性小，移植物抗宿主病反应低，干细胞不受疾病、衰老等影响，脐带血干细胞在血液系统和免疫系统疾病治疗方面越来越受到重视[13]。

脐带血自储存到应用会有一段时间的液氮冻存，因条件限制，在移植使用前不可能获得该份脐带血现实、真实的数据，临床医生选用脐带血的参考依据为冻存前的检测数据，脐带血是否有传染病？是否有微生物污染？经冻存后的脐带血质量指标是否会下降？随着冻存年限的增加，细胞质量是否会逐年降低？这些都是临床医生所关心的问题。

本研究对当初的检测标本进行了传染病指标检测，因新生儿出生前未与外界接触，传染病的唯一途径为母婴垂直传播，鉴于新生儿免疫系统未完全建立及胎盘有一定的屏障作用，筛查母血的传染病指标有相当的必要性。考虑到试剂灵敏度或标本混淆等因素的影响，脐带血移植前，对移植脐带血当初留样的母血、脐带血标本进行传染病检测，检测结果完全一致。用冻存管保存的复检标本储存在-20 ℃冷库，经过多年的储存，复检标本量能够满足检测，但是有部分标本的量变少或冻干(当初留样为2管，冻干的启用另一管)，复检标本冻存管的密封性及保证复检标本的量不减少是脐带血储存多于20年需要注意的问题。

冻存干细胞的方法有先暂存于-80 ℃冰箱，然后转移至液氮中[9-10,14]。许利民等[9]曾报道，脐带血干细胞在-80 ℃冰箱可以有效保存3个月，6个月后存在部分细胞损害，此时的脐带血不适合作为干细胞移植。脐带血经过程控降温后保存于-196 ℃的液氮中12个月、几年甚至十几年后，仍有很高的细胞活性[9-13]。通常认为-80 ℃时，细胞内外各种溶质基本达到平衡，此时细胞内酶的活性基本消失，但仍有微量生命活动，仍然会消耗能量，不适合长时间保存。-196 ℃的液氮深低温冷冻保存能阻断各种酶的活性和细胞代谢，可长期保存细胞并保存细胞活力。

评价外周血干细胞主要是用体外方法检测复温后有核细胞、CD34+细胞和造血集落培养及细胞活性[14]。本研究发现，冻存前200份脐带血的TNC均值为(11.2±4.8)×108，冻存20年后复苏TNC均值为(10.1±4.0)×108，TNC回收率为90.18%，活性回收率为75.78%。许利民等[9]研究发现，冻存12个月后平均细胞活力仍为90.86%。时庆等[10]研究了冻存16年的34份脐带血复苏前后的情况，TNC回收率平均为79%。章毅等[11]比较了605份冻存干细胞的TNC回收率，1年内为83.3%，1～2年为84.3%，>2～3年为84.7%，3年以上为85.9%。ANAGNOSTAKIS等[15]分析了105份液氮冻存6～36个月的脐带血标本，平均TNC回收率为79.48%。LEE等[16]研究脐带血TNC回收率、细胞活力并不与冻存时间呈负相关。推测冻存液氮后，细胞基本活动停止，其各项指标较入库前有降低的情况，主要与冻存和复苏的过程有关，细胞经历降温和复温的过程，会引起细胞内形成冰晶及渗透压改变，过程中有部分细胞不可避免地受到损伤。细胞活性有一定比例的损失，主要是已分化成熟的细胞，这部分细胞丢失并对移植影响不大。

CD34+细胞是造血干/祖细胞的一个重要表面标志，CD34+细胞及总有核细胞数能够反映细胞的质量。本研究采用双平台进行CD34计数，200份标本的平均CD34数目是冻存前的77.42%，发现TNC的损失接近10%，因为双平台的原因，CD34+实际数目比冻存前远远大于77.42%，鉴于双平台的误差存在计数仪与流式细胞仪2个过程与设备，后续会尝试采用单平台的绝对计数。CFU-GM是造血干细胞增殖能力的指标，冻存20年的标本能够很好地形成集落，说明干细胞有很强的增殖能力。

目前，临床医生考虑移植效果主要关注TNC、CD34+、CFU-GM和活性，冻存20年的脐带血虽然指标较冻存前有所降低，但是细胞各项指标仍符合质量标准。临床医生在选择脐带血时不需要过多关注脐带血的冻存年限，更多的是需要关注脐带血的质量。