GeneXpert检测系统分析儿童耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药基因*

王 维，王 林

1.陕西省西安市儿童医院检验科，陕西西安 710003；2.陕西省西安市第一医院检验科，陕西西安 710002

肠杆菌科细菌是儿童专科医院引起临床感染的重要病原菌之一，有研究统计显示，儿童60%的感染由革兰阴性菌引起[1-2]。耐碳青霉烯类抗菌药物因其抗菌谱广且作用强，经常作为强效β-内酰胺类抗感染药物治疗肠杆菌感染[3]。伴随碳青霉烯类抗菌药物的广泛使用，全球耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)菌株也逐年升高，耐药菌株对抗菌谱较窄的儿童感染的控制和治疗造成诸多困难，已成为紧迫的公共卫生问题[4-6]。肠杆菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制大体相同，但耐药基因具体流行分布情况在不同种属间仍存在差异。因此,CRE耐药基因的鉴定及分子机制的深入研究，对临床治疗及预防耐药菌传播意义重大。GeneXpert分子诊断平台是核酸提取扩增检测一体化系统，半巢式实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)可快速检测感染性疾病病原及耐药性基因，此方法较传统细菌培养及普通 PCR 具有快速、准确、灵敏度高等特点。GeneXpert检测系统现已应用于结核分枝杆菌利福平耐药基因、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)及CRE等耐药基因的检测[7]。本文采用GeneXpert检测系统快速鉴定分析CRE的耐药基因表型，为临床合理用药及科学预防控制CRE的流行提供理论依据。

1 材料与方法

1.1菌株、仪器及试剂 选取西安市儿童医院2017年10月至2019年10月各类标本分离的CRE，剔除同一患者的重复菌株，共收集109株。基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪(德国布鲁克公司)；药敏板卡AST-GN13(法国梅里埃生物制品有限公司)；琼脂培养基(中国郑州安图生物工程股份有限公司)；GeneXpert仪器试剂(美国赛佩公司)；Vitek 2-Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统(法国梅里埃生物制品有限公司)；细菌培养箱(日本索尼公司)。

1.2方法

1.2.1菌株鉴定和药敏试验 将收集保存于-80 ℃冰箱的菌株复苏培养18～24 h后用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪进行鉴定；同时采用Vitek 2-Compact全自动微生物鉴定和药敏分析系统进行药敏试验。结果判断参考美国临床和实验室标准协会2019年标准，ATCC25922为质控菌株。

1.2.2GeneXpert检测系统检测细菌耐药基因 挑取单个菌落配制浓度0.5麦氏单位的菌悬液，吸取10 μL加至GeneXpert试剂标本处理液中，漩涡震荡混匀，吸取1.7 mL 混合液沿管壁加入试剂盒内，扫码上机启动检测。

1.3统计学处理 采用Whonet5.6软件分析药敏试验结果，其他数据采用SPSS19.0软件进行统计分析。计数资料以例数或百分率表示，组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CRE、标本及科室分布情况 109株CRE以肺炎克雷伯菌最多，为57株(52.29%)，其余依次为大肠埃希菌[20株(18.35%)]、产酸克雷伯菌[8株(7.34%)]、奇异变形杆菌[6株(5.50%)]、阴沟肠杆菌[5株(4.59%)]、其他菌株[13株(11.93%)]。CRE标本来源以尿液为主[39 株(35.78%)]，其次为下呼吸道标本[32株(29.36%)]及脓液[18株(16.51%)]，以上3种标本占所有检出标本的81.65%，具体标本来源分类见表1。CRE在新生儿重症医学科及儿童重症医学科分离得最多,共34株，占31.19%，其他分离较多的科室依次为康复科[18株(16.51%)]、血液科[15株(13.76%)]、呼吸科[13株(11.93%)]、肾脏科[10株(9.17%)]、普外科[8株(7.34%)]。

表1 109株CRE标本来源及构成比

续表1 109株CRE标本来源及构成比

2.2CRE药敏试验结果 药敏试验结果显示，CRE对头孢类药物呈高度耐药，耐药率>80.0%，对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星及左氧氟沙星有相对较好的敏感性，耐药率均<30.0%，其中阿米卡星敏感性最好，耐药率仅为7.1%，未分离到多黏菌素耐药的菌株，具体耐药情况见表2。

表2 CRE对18种抗菌药物的药敏试验结果(%)

2.3CRE耐药基因检测结果 GeneXpert检测系统共检测了KPC、NDM、IPM-1、VIM、OXA-48等5种耐药基因，携带碳青霉烯酶菌株共90株，耐药基因检出率分别为KPC(52.29%)、NDM(47.70%)、IMP-1(7.30%)，未发现VIM和OXA-48耐药基因。仅携带 KPC 酶 33株(30.28%)，仅携带NDM 酶 31 株(28.44%)，仅携带 IMP-1 酶 2株(1.83%)，同时携带 KPC 和 NDM 酶 18 株(16.51%)，同时携带 KPC和 IMP-1 酶3株(2.75%)，同时携带IMP-1、KPC和NDM酶3株(2.75%)，未检出VIM及OXA-48，19株菌株未检出任何耐药基因，总体耐药基因检出率为82.57%。质控菌株ATCC25922未检出耐药基因。

2.4耐药基因检出数量与患儿预后情况分析 临床分离耐碳青霉烯类菌株中未检出耐药基因，检出1种耐药基因及两种及以上耐药基因对患儿预后差异无统计学意义(χ2=2.235,P=0.327)，见表3。

表3 CRE耐药基因检出情况与患者预后分析(n)

3 讨 论

作为社区和院内感染的重要病原之一，CRE可引起人体多部位感染。碳青霉烯类抗菌药物因其稳定性高、通透性好、抗菌谱广，在临床应用较多，甚至有过度治疗的情况,该类药物的不合理使用，致使CRE检出率逐年升高[8]。本研究结果显示，2017年10月至2019年10月西安市儿童医院共分离出耐碳青霉烯类CRE 109株，分析不同菌种CRE构成比，肺炎克雷伯菌最多，占52.29%，这与文献[9]报道一致。分析西安市儿童医院CRE标本来源发现，前3位标本类型为尿液、下呼吸道标本及脓液。有文献指出，儿童泌尿系感染较多且抗感染治疗时间长会导致耐药菌株大量出现，此现象与西安市儿童医院CRE标本来源一致，同时呼吸道标本及脓液送检量多也与此两种标本CRE检出率高有关[10]。

本研究结果显示，西安市儿童医院CRE对常用抗菌药物呈高度耐药(耐药率>80.0%)，但不同于成人，儿童对左氧氟沙星、庆大霉素、阿米卡星等耐药率较低(耐药率<30.0%)，主要与此类药物对儿童不良反应大，或临床治疗较少应用有关。分析结果提示，当药物缺乏或病情相对较轻时，可考虑阿米卡星等药物经验性治疗。CRE对第4代头孢菌素(头孢吡肟)的耐药率低于亚胺培南和美罗培南，此结果与文献[11-12]报道一致。此外，已对头孢吡肟敏感菌株各试验环节进行复核确认，均未发现异常情况。对于此耐药模式可能原因如下：首先，仪器检测方法学限制，VITEK药敏不是真正意义上的浓度梯度稀释法，而是通过监测 4～6个抑菌浓度点，由公式换算得出最小抑菌浓度(MIC)值，可能与真实MIC值不完全一致；其次，某些CRE 是各种复杂耐药机制相互作用、制约、拮抗导致的结果，对体外抗菌药物敏感并不代表临床治疗有效；最后，此耐药模式还可能与菌株数量、本地区儿科用药习惯、区域流行菌株不同等有一定关系。多黏菌素被认为是治疗CRE最后的“杀手锏”，西安市儿童医院尚未分离出多黏菌素耐药菌株。文献[13]指出，联合用药(多黏菌素类或阿米卡星联合碳青霉烯类抗菌药物)对于CRE的治疗效果更佳。

CRE的主要耐药机制是携带产碳青霉烯酶基因，按β-内酰胺酶家族Ambler分类分为A、B、D三类，A 类中最具临床意义的酶型是 KPC,B类包括NDM、IMP-1、VIM等，D类主要为OXA-48，其中NDM基因被认为是儿童产生耐碳青霉烯酶细菌的关键基因[5，14]。本研究借助GeneXpert检测平台对KPC、NDM、KPC、IPM、VIM、OXA-48等5种常见耐药基因进行检测，109株CRE中耐药基因检出率为82.57%,其中KPC型57株、NDM型52株、IMP-1型8株，未检出VIM和OXA-48型，KPC+NDM检出率为16.51%，由此提示西安市儿童医院儿童分离CRE的主要耐药基因为KPC和NDM，此结果与文献[15-16]报道一致，与文献[17]报道的NDM为主型存在差异。西安市儿童医院肺炎克雷伯菌检出率高且以KPC和NDM型为主，可能与产KPC-2的肺炎克雷伯菌可以克隆传播有关，其编码基因通过插入序列、质粒及整合子等基因元件进行水平传播。文献[17]报道，亚洲国家发现在不同大小和不相容类型的质粒中存在的耐药基因NDM-1基因，其可通过接合转移在细菌间传播，这些原因都导致了耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的广泛传播。临床回访发现，是否检出耐药基因及检出耐药基因数量与患者病情转归差异无统计学意义(P>0.05)。

CRE耐药机制复杂，常表现为多重耐药，导致其感染后较难治愈。本研究针对儿童临床使用碳青霉烯类药物抗感染较多，采用GeneXpert检测系统快速、 准确分析儿童耐碳青霉烯类CRE的基因分型及耐药特征，以了解医院CRE耐药情况及耐药机制，指导临床合理使用抗菌药物，同时注意医院感染的预防和控制，以降低儿童耐药菌株的传播流行。