石榴健胃散干预对实验性结肠炎小鼠肠道免疫功能的影响※

申香群，仁增多杰，马倩倩，朱沁芳，Mohamed Magged，张 伟，任延明

(青海大学医学院；青海省高原医学应用基础重点实验室)

大肠杆菌可以与人体内共生菌同时寄生于胃肠道中而不引发疾病，但是部分分型的大肠杆菌如肠源性大肠杆菌(EPEC)和肠出血性大肠杆菌(EHEC)等具有致病性。在一些地区，EPEC和EHEC依然是腹泻致死的重要病因[1]。因此，对于EPEC、EHEC发病机制的研究具有重要意义。枸橼酸杆菌(Cirtrobacterrodentium，C.rodentium)是一种小鼠特异性革兰氏阴性杆菌，毒力基因序列及形成的病理损伤机制与人类感染EPEC、EHEC具有相似性，常用于研究人类大肠杆菌感染。因此，本研究以C.rodentium感染小鼠模型模拟EPEC、EHEC对人类的感染。石榴健胃散出自《四部医典》，主要用于治疗腹泻。现代医学发现，石榴具有抗氧化、抗炎、抗感染的作用。本研究依此探讨石榴健胃散干预对C.rodentium感染小鼠肠道免疫功能的影响。

1.材料与方法

1.1 实验动物

8周龄SPF级BALB/c雌性小鼠24只，体重18～20 g，购于湖南史莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0004。动物的使用和处理经过青海大学医学院实验动物伦理委员会批准。

1.2 实验试剂与仪器

1.2.1 石榴健胃散购自青海省藏医院，依据《四部医典》要求煎煮，以水煎煮，煎成100%(1g/mL)的中药原液。

1.2.2 ELISA所用抗小鼠CD3抗体(Anti-CD3)、抗小鼠1stAb、抗小鼠2ndAb、标准品(IL-10、IL-17、IFN-γ、IgG2a)试剂均购自BD公司，RNA逆转录试剂购自Takara Bio公司，引物购自宝生物工程(大连)有限公司，H&E试剂购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.2.3 酶标仪(infinite M200PRO)购自TECAN公司，冷冻离心机(Centrifuge 5430 R)购自Eppendorf公司，恒温培养振荡器(ZWY-200D)购自上海智城分析仪器制造有限公司，荧光定量PCR仪(CFX96 Optic Module)购自BIO-RAD公司，冰冻切片机(HM525)购自Thermo scientific公司，紫外分光光度计(22331 Hamburg)购自Eppendorf公司。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组与模型建立

将小鼠置于温度为(20±2)℃、相对湿度为(35±5)℃的IVC通气鼠框中适应性饲养7 d后随机分成4组。分别为正常组、药物组(1.5g/kg)、感染组、感染+药物组(1.5g/kg)，周期为21 d。正常组连续灌胃(无菌水，0.10mL/10g/d)21 d；药物组连续灌胃(石榴健胃散，0.10mL/10g/d)21 d；感染组连续灌胃(无菌水，0.10mL/10g/d)21 d，第8 d给予一次细菌灌胃(C.rodentium，1×109CFU/只)处理；感染+药物组连续灌胃(石榴健胃散，0.10mL/10g/d)21 d，第8 d给予一次细菌灌胃(C.rodentium，1×109CFU/只)处理。为避免肺部误吸和降低样本间的差异，小鼠需提前禁食8 h再给予细菌灌胃。

1.3.2C.rodentium活化和准备

首先将储存的C.rodentium(strain DBS100)冻存液于室温解冻30 s，用无菌环在菌液表面轻轻刮取，在LB液体培养基培养至菌液浑浊，然后采用四区画线法将细菌接种在麦康凯培养基平板上，并将平板置37 ℃恒温箱培养过夜。第二天用无菌环取平板上单个菌落置于装有25 mL LB液体培养基的锥形瓶中，将锥形瓶置恒温培养振荡器中(200rpm/min，37℃)过夜培养。第三天先用分光光度计测量菌液在600 nm处的光密度，然后将菌液在新的锥形瓶中稀释成OD600nm为0.1的浓度继续在恒温培养振荡器中(200rpm/min，37℃)培养4～6 h，使菌液OD600 nm浓度至1～1.5(细菌生长对数期)，最后根据所需要的细菌总数取相应菌液离心、PBS洗涤、再离心，加入所需体积无菌水。灌胃，完成造模。

1.3.3 实验动物取材及标本处理

收集感染后第2、6、10、13 d小鼠粪便涂板，观察细菌定植及负荷。以CO2麻醉小鼠，用75%的酒精消毒后开腹。取肠系膜淋巴结研磨、计数、定量，以Anti-CD3刺激制备细胞上清液冻存于-80 ℃冰箱；测量结肠长度；取0.5 cm远端结肠用OCT包埋做冰冻切片；以PBS冲洗结肠粪便，剪碎结肠组织冻存于-80 ℃冰箱。

1.4 表观指标观测

间隔一日观测小鼠体重变化，注意小鼠毛发及精神状态，关注小鼠腹泻情况。

1.5 IgG2a含量检测

采用ELISA法检测：将小鼠新鲜血液收集于1.5 mL的EP管中，于室温静置2 h离心(6000rpm/min，15min)，分装血清(50μL/管。防止反复冻融)，按照常规方法检测IgG2a含量。

1.6 肠系膜淋巴结T淋巴细胞培养液上清中相关炎症因子检测

采用ELISA法检测：取肠系膜淋巴结，用橡皮塞轻柔研磨、细胞计数仪计数，定量为每孔1×107个细胞，以Anti-CD3刺激，收集上清，余同IgG2a检测步骤。γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-10(IL-10)、白介素-17(IL-17)含量检测方法同上。

1.7 其他相关指标检测

采用荧光定量PCR法检测：取冻存的结肠组织，根据RNA Trizol提取法提取组织中的RNA并检测，保证其纯度OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之间，调整其浓度在500～600 ng/μL之间，然后根据说明书进行去基因组DNA、反转录步骤得到cDNA模板，最后通过荧光定量PCR法检测相关指标。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.8 统计学处理

2.结果

2.1 体重

表2显示，同一处理组小鼠在不同观察天数、不同处理组小鼠在同一观察天数的体重变化均无统计学差异。

表2 不同组小鼠体重

2.2 结肠长度

表3显示，与正常组比较，感染组小鼠结肠长度明显缩短(P<0.05)。与感染组相比，感染+给药组小鼠结肠长度明显增长(P<0.05)，并且与药物组相比，结果无统计学差异。结果提示石榴健胃散干预能缓解Cr细菌感染引起的结肠长度缩短情况。

表3 不同组小鼠结肠长度

2.3 排菌量

表4显示，对小鼠连续排菌量使用重复测量法统计，结果显示同一组小鼠在不同时间点的排菌量存在明显差异(F=13.386，P=0.001)，不同组小鼠排菌量在同一时间点无显著差异(F=0.343，P=0.795)。与感染组相比，感染+给药组排菌量稍有增加，但尚未达到统计学意义，结果提示石榴健胃散干预在早期不会影响C.rodentium在小鼠体内的定植。

表4 两组小鼠在不同时间点的排菌量

2.4 血清IgG2a抗体浓度

表5显示，与正常组比较，感染组小鼠血清IgG2a抗体表达显著增加(P<0.05)；与感染组比较，感染+药物组小鼠血清抗体亦显著增加(P<0.05)，结果提示石榴健胃散的干预能够促进机体IgG2a表达。

表5 不同组小鼠血清IgG2a抗体浓度

2.5 肠系膜淋巴结T淋巴细胞培养液上清中炎症因子浓度

表6显示，与对照组比较，感染组IFN-γ、IL-17、IL-10含量均显著升高(P<0.05)；与感染组比较，感染+给药组IFN-γ含量显著降低(P<0.05)，IL-10含量显著升高(P<0.05)，IL-17含量无明显变化，结果提示石榴健胃散干预能够抑制炎症因子IFN- γ表达，促进抑炎因子IL-10表达。

表6 不同组别小鼠肠系膜淋巴结细胞因子浓度

2.6 细胞因子及转录因子的表达量

表7显示，与正常组相比，感染组IFN-γ、TNF-α、T-bet、IL-17、RORrt、IL-10 mRNA表达量均显著增加(P<0.05)；与感染组相比，感染+药物组IFN-γ、TNF-α、T-bet mRNA表达量均显著下降(P<0.05)，IL-17、RORrt mRNA表达量无明显变化，IL-10 mRNA表达量明显增加(P<0.05)。结果显示C.rodentium感染会促进Th0向Th1和Th17方向分化，石榴健胃散干预能够抑制Th0向Th1方向分化，对Th0向Th17方向的分化无明显影响。

表7 不同组小鼠结肠组织中细胞因子的mRNA表达情况

2.7 H.E.染色结果

H.E.染色结果见图1。正常组小鼠结肠病理图片显示，肠上皮细胞紧密排列，肠上皮结构完整，杯状细胞和炎性细胞数目较少。药物组小鼠结肠病理图片与正常组无明显差异。在感染组小鼠结肠病理图片中可以看到肠上皮细胞出现一定程度的脱落(如箭头所示)及隐窝的延长和杯状细胞的增多，并可见炎性细胞增多，局部出现淋巴滤泡。感染+给药组小鼠病理结果显示肠上皮结构在一定程度上保持完整，炎症细胞聚集减少，伴随杯状细胞的明显增多，隐窝延长现象同样存在，从整体看，结肠组织损伤较轻。上述结果显示石榴健胃散在一定程度上能够降低细菌感染导致的结肠组织损伤。

A：正常组；B：药物组；C：感染组；D：感染+药物组

3.讨论

炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)是一组病因不明的慢性、易复发性肠道炎症疾病，包括溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis，UC)。C.rodentium感染模型是国际公认的一种啮齿类动物IBD实验模型。C.rodentium是一种细胞外鼠特异性病原体，主要通过利用A/E病变与粘膜炎症结合来定植于肠上皮屏障表面。C.rodentium感染小鼠时主要定植于结肠和盲肠的管腔和粘膜表面[2]，通常表现出体重减轻、腹泻、隐窝增生、杯状细胞丢失和淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞等各种炎性细胞浸润结肠固有层，导致结肠炎形成。宿主对C.rodentium的免疫反应主要表现为CD4+T细胞大量浸润到结肠固有层，上皮CD8+T细胞略有增加[3]。因此，本研究主要从CD4+T细胞的方向，研究石榴健胃散干预在C.rodentium感染中的免疫调节作用。

当宿主受到C.rodentium感染后，机体会出现明显的Th1反应增强[4]，主要表现在IFN-γ、TNF-α的表达量增高，这些炎症因子的增加会破坏线粒体磷酸化功能[5]，线粒体功能障碍促进上皮细胞凋亡，导致肠上皮屏障破坏[6]；同时，IFN-γ、TNF-α表达的增加会降低粘膜表面粘蛋白含量、杯状细胞的丰满度和影响粘膜形态的完整性[7]，使细菌与上皮细胞接触增加，引发炎症反应过度，进而加重结肠组织损伤。因此，抑制Th1反应有助于保护宿主免受C.rodentium导致的组织损伤。本研究显示，感染组小鼠IFN-γ、TNF-α、T-bet转录因子表达升高，在给予石榴健胃散干预的感染小鼠中，这些指标出现下降趋势，提示石榴健胃散干预可能通过抑制Th0细胞向Th1细胞方向的分化，抑制Th1细胞分泌IFN-γ、TNF-α炎症因子来保护结肠组织。

最新研究显示，Th17细胞介导的免疫反应也参与了宿主对C.rodentium感染的防御。然而，Th17细胞介导的免疫反应存在双重作用[8]：一方面Th17细胞介导的免疫反应有益于宿主，通过阻碍细菌向全身器官的扩散来遏制粘膜炎症的继续发展；另一方面，在感染早期，细菌正是通过Th17炎症反应黏附于肠上皮细胞上，并与肠道内其他微生物竞争肠道营养物质实现更大的定植[9]。有研究发现感染后期IL-17的表达有利于机体对细菌的清除，IL-17通过招募中性粒细胞到达炎症部位清除体内定植的细菌。本研究显示，石榴健胃散干预并不会影响细菌感染导致的IL-17的高表达。

IL-10是常见的炎症抑制因子，主要由Treg细胞分泌。IL-10对于宿主清除体内定植的细菌无促进作用。然而，有研究显示，CD4+T细胞缺乏IL-10会加重IFN-γ、IL-17促炎因子的表达[10]。由此可知，IL-10主要通过发挥免疫抑制作用来阻碍过度的炎症反应引起的组织损伤。本研究发现，石榴健胃散干预能促进感染小鼠IL-10的表达，抑制炎症反应造成的结肠组织损伤。

有研究指出，当机体受到C.rodentium细菌感染后，细菌的清除主要依赖于B细胞产生的免疫球蛋白并非分泌性免疫球蛋白A(IgA)或IgM[11]，其中主要发挥清除作用的抗体是IgG2a[12]。由于B细胞介导的体液免疫同样需要T细胞激活介导[13]。在感染后12 d左右，CD4+T细胞才发挥对细菌的清除作用，IgG2a表达增加还不足以对细菌的清除在第13 d达到显著效果。因此，本研究存在一定缺陷，对于粪便排菌量的观察时间应当延长。本研究发现，经石榴健胃散处理能促进感染小鼠IgG2a的表达，提示石榴健胃散干预可能促进B细胞的表达发挥细菌清除作用。

IBD的主要症状是腹泻，中医根据腹泻这个主要症状一般将IBD归于泄泻这一疾病。中医关于泄泻的记录早在《皇帝内经》中已有记载，如《素问气交大论》记载“殤泻”“注下”等病名。后世关于泄泻的病因病机研究一直在完善。虽然泄泻的病因病机复杂，但发病机理可以归纳为脾虚湿盛。泄泻的病位在大肠，主病之脏在于脾，与肝、肾的关系同样密不可分。石榴健胃散主要成分为温性药物，因此，临床治疗常用于寒性腹泻。现代医学研究发现，石榴籽主要含多种挥发油和脂肪酸，石榴籽油具有增强体液免疫和激活巨噬细胞的作用[14]；藏红花活性成分主要为红花黄素，能抑制IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎因子的表达[15]；肉桂主要有效成分为肉桂醛，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等具有抗炎活性[16]。概而言之，石榴健胃散具有抗炎、抗菌、免疫调节作用。

综上所述，石榴健胃散的干预能够通过抑制C.rodentium感染引起的Th1反应的增强、促进B淋巴细胞参与体液免疫发挥免疫调节作用。