重组腺病毒介导的HIF-2α过表达对孕鼠的影响※

马 萌，谢莹莺，赵世晨，徐梦婷，何岑盈

(1.青海大学附属医院；2.南阳市中心医院；3.天津医科大学临床医学院)

目前子痫前期的发病机制尚不明确。关于其发病机制观点多样，其中普遍认为子痫前期共有的发病机制是子宫螺旋动脉滋养细胞重铸障碍致胎盘缺血缺氧。低氧诱导因子-2α(hypoxia inducible factors-2α，HIF-2α)作为一种低氧诱导因子在机体的生长、发育中起到重要作用。已有研究表明，生活在高海拔低氧环境下的女性比生活在海平面的女性更容易患子痫前期[1]，而子痫前期存在HIF-2α蛋白高表达，但HIF-2α在子痫前期的发病机制中的作用尚不清楚。目前，对HIF-2α过表达对机体影响的研究结论不一，本研究拟通过重组腺病毒介导的HIF-2α过表达明确其对SD孕鼠的影响，并初步探讨子痫前期发病机制。

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SD雌性和雄性大鼠，周龄10～12周，体重230±20 g，SPF级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号：SCXK(京)2016-0006]。

本动物实验通过青海大学附属医院伦理委员会审批，批号：P-SL-2017064。

1.1.2 试剂及仪器

稳定表达HIF-2α的重组腺病毒购于汉恒生物科技(上海)有限公司，乌拉坦购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司，免疫组化试剂购于武汉博士德生物有限公司。大鼠无创血压仪购于安徽正华生物仪器设备有限公司，大鼠代谢笼购于苏州工业园区唯亭姑秀实验动物设备厂，低速台式离心机购于上海安亭科学仪器厂，免疫组化所用仪器购于北京嘉信科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物处理

1.2.2 血压测量

所有孕鼠分别于妊娠第9、19 d运用无创血压仪测血压。测量方法：将测血压系统安装在电脑上，连接血压仪，设置通道和固定参数。在室温、安静环境下，将孕鼠置固定笼内并露出尾根部，温度调至38 ℃预热10 min，在孕鼠尾根部依次套入充气球、血压换能器(孕鼠尾部与血压换能器紧密贴合)，待孕鼠脉搏波形稳定后，打开充气球开关，完全充气并慢慢放气后，读取孕鼠收缩压、舒张压(每两次血压测量间歇应大于1min)，测量3次，求其平均值。

1.2.3 尿液留取

所有孕鼠分别于妊娠第9、19 d置入大鼠代谢笼内，禁食不禁水，收集孕鼠24 h的尿液。将尿液移入无菌离心管中离心10 min(4000rpm，4℃)，吸取上清液至另一无菌离心管内，记录尿量并标记后统一运用全自动生化分析仪测量24 h尿蛋白量。

1.2.4 处死

所有孕鼠在妊娠第19 d测量血压、收集尿后于腹腔注射乌拉坦麻醉(20%，5mL/kg)，固定孕鼠，用蒸馏水湿润腹部，打开腹腔，分离腹腔器官使下腔静脉充分暴露，留取下腔静脉血，运用全自动生化仪检测ALT、ALB、BUN、Cr。用无菌剪切开子宫，记录仔鼠个数及重量，剪取胎盘，置4%甲醛溶液中固定，做免疫组化分析。

1.2.5 免疫组化结果判定

HIF-2α蛋白主要表达于胎盘滋养细胞胞核、胞浆中，HE染色为棕黄色时视为阳性。在每张免疫组化片子随机选取20个高倍视野观察HIF-2α表达情况，根据染色程度和染色细胞占视野总细胞的百分比综合计算：(1)无染色记为0分，淡棕色染色记为1分，棕黄色染色记为2分，深棕黄色染色记为3分；(2)无阳性细胞记为0分，阳性细胞<30%记为1分，阳性细胞30%～50%记为2分，阳性细胞>50%记3分。总评分=(1)+(2)/2，总评分<1分记为阴性表达，总评分≥1分记为阳性表达[2，3]。

1.2.6 统计学分析

使用SPSS 23.0 软件对数据进行统计学分析，计量资料数据用均数±标准差表示，对同一处理组的处理前后比较使用配对t检验，对不同处理组间比较采用单因素方差分析，多重两两比较采用Bonferroni法，不同处理组HIF-2α表达阳性率比较采用卡方检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2.结果

2.1 血压

妊娠第19 d，重组腺病毒组收缩压、舒张压与妊娠第9 d相比，收缩压、舒张压明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；妊娠第19 d，与盐水组、空白腺病毒组相比，重组腺病毒组收缩压、舒张压明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 不同处理组收缩压与舒张压

2.2 尿蛋白

重组腺病毒组妊娠第19 d的24小时尿蛋白与妊娠第9 d相比，24小时尿蛋白明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，妊娠第19 d，与盐水组、空白腺病毒组相比，重组腺病毒组24小时尿蛋白明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 不同处理组24小时尿蛋白值

2.3 肝肾功能

不同处理组孕鼠ALT、ALB、BUN、Cr无明显差异(P>0.05)，见表3。

表3 不同处理组肝肾功能值

2.4 仔鼠均重

与盐水组、空白腺病毒组相比，重组腺病毒组仔鼠均重明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 不同处理组仔鼠均重

2.5 免疫组化

不同处理组HIF-2α表达比较，重组腺病毒组HIF-2α表达高于盐水组、空白腺病毒组(P<0.05)，见表5。

表5 不同处理组HIF-2α表达情况

3.讨论

3.1 HIF-2α与子痫前期

胎盘最初是在含氧量为1%的低氧环境中发育，直到怀孕10周后。在此期间，氧浓度对滋养细胞活性有重要影响，HIF被认为是影响妊娠前期滋养细胞行为的重要调节因子之一[4]。其中HIF-1和HIF-2(即Endothelial PASdomain-containing protein，EPAS1)是细胞在缺氧应答反应中最重要的调节因子，它们均是一种由α亚基和β亚基组成的异质二聚转录因子，其中α亚基是应对缺氧的主要亚基，在常氧下迅速分解失活，而β亚基是基本亚基。EPAS1驱动慢性缺氧反应，而HIF-1α参与了对急性缺氧的细胞反应，有研究表明低氧状态下为使内皮细胞维持氧平衡状态，HIF-2α可能替代HIF-1α起作用[5]。Rajakumar[6]、LiuW[7]的研究显示，子痫前期胎盘中HIF-2α的蛋白表达增加，而胎盘中的HIF-1α并未增加。Depoix C L[8]的研究显示，是EPAS1，而不是HIF-1α，可能在滋养细胞分化过程中、在基因表达调控中起重要作用。在Qin L[9]的研究中发现，通过沉默真核翻译起始因子降低HIF-2α的表达可使子痫前期大鼠模型的临床表现得到改善，并抑制PE大鼠高血压和尿蛋白的出现。以上研究都说明HIF-2α与子痫前期关系密切，也是我们选择HIF-2α而不是HIF-1α作为研究因子的原因。曲新霞[ 10]通过细胞实验研究发现，低氧环境下的表达下降HLA-G可能通过影响滋养细胞增殖活性及侵袭能力参与妊娠期高血压疾病发生。在Rueda-Clausen C F[11]的研究中将正常孕鼠与子痫前期孕鼠暴露于10.5%的氧气浓度下8 d后，正常孕鼠血压、尿蛋白明显增加，仔鼠体重、生存率下降。子痫前期孕鼠血压进一步上升、尿蛋白增加。以上说明低氧与子痫前期关系密切，并在子痫前期发病中占有重要作用。HIF-2α作为重要的低氧调节因子，HIF-2α的表达变化是否与子痫前期有关、是否参与子痫前期发病机制是本研究的目的。

3.2 HIF-2α过表达对孕鼠的影响

子痫前期的典型特征是高血压和尿蛋白，鲜有HIF2α过表达对孕鼠影响的研究，本研究尚处于摸索研究阶段。我们于妊娠第9 d注射腺病毒，此时孕鼠处于孕中期，仔鼠已发育稳定，外界干预不易致流产，利于整个实验的进行，而大鼠整个孕期在20 d左右，我们选择了妊娠第19 d进行解剖。对于鼠尾注射病毒的剂量，过低可能达不到预期的结果，过高可能对孕鼠产生严重不良影响，查阅有关腺病毒注射类文献后，最后确定了本研究孕鼠注射病毒剂量。为了研究腺病毒是否对孕鼠产生影响，我们设置了空白病毒组来对照。结果在妊娠第19 d，重组腺病毒组收缩压、舒张压、尿蛋白与妊娠第9 d相比显著升高，尿蛋白增加了近10倍，而盐水组及空白腺病毒组收缩压、舒张压、尿蛋白与妊娠第9 d相比无显著差异，说明注射腺病毒对孕鼠血压、尿蛋白无明显影响，而注射重组腺病毒介导的HIF-2α过表达使孕鼠产生高血压和尿蛋白，即子痫前期症状，虽然收缩压、舒张压升高程度未达人类高血压判定标准(可能与注射腺病毒剂量不足或动物子痫前期尚无统一判定标准有关，具体剂量有待进一步研究)，但较对照组还是明显升高了。本研究在青海西宁完成(海拔2200m)，属于低氧区，但盐水组、空白病毒组未出现血压明显变化，与低氧地区子痫前期发病率高不一致，可能跟海拔高度不够高和组数少、低氧时间短暂有关系，这也从反面说明重组腺病毒组孕鼠产生的一系列子痫前期症状与2 200米海拔无明确关联。

在研究结果中我们看到三组肝肾功能指标ALT、ALB、BUN、Cr无明显差异，并未出现注射腺病毒产生的特异性肝炎所致的肝酶升高，可能与大鼠肝肾功能没有统一判定标准、孕鼠研究样本有限及注射腺病毒剂量不足有关。而本研究中注射腺病毒未出现肝肾功能指标的上升，也排除了注射腺病毒所致肝肾功能改变对孕鼠血压、尿蛋白的影响，随后可以在肝脏、肾脏病理学中寻求验证。

胎儿宫内生长受限(Intrauterine growth restriction in utero，IUGR)，被定义为胎儿未能达到其基因决定的生长潜力，在大约25%的子痫前期中存在[12 ]。IUGR虽然不是子痫前期特异性的表现，但IUGR与子痫前期具有共同的病理生理学特征，且与子痫前期导致的绒毛外滋养细胞浸润不足、子宫螺旋小动脉重铸障碍密切相关，可以间接反映子痫前期的病情。在妊娠第19 d，重组腺病毒组仔鼠体重显著低于盐水组和空白病毒组，而盐水组与空白病毒组无明显差异，说明鼠尾注射重组腺病毒介导的HIF-2α过表达使仔鼠产生了IUGR。胎盘免疫组化结果提示HIF-2α蛋白在盐水组和空白腺病毒组低表达，而在重组腺病毒组呈高表达，从反面验证了HIF-2α过表达可使SD孕鼠产生子痫前期症状，这与Rajakumar[ 6]、Liu W[ 7]及李淑丽[13]的研究结论一致。

本研究通过重组腺病毒介导的HIF-2α过表达使SD孕鼠产生子痫前期症状，致胎儿宫内生长受限(在胎盘免疫组化中得到了验证)，说明HIF-2α参与了子痫前期的发病，但具体的分子机制尚不清楚，有待学者进一步研究。