槲寄生联合远程缺血后适应对缺血再灌注心肌保护作用的影响

栾海蓉 代海兵 魏 韬 李 丽 王得利

牡丹江医学院机能学教研室，黑龙江牡丹江 157011

缺血的组织器官恢复血流灌注后，不但不能使其功能和结构恢复，反而加重其功能障碍和结构损伤的现象称为缺血-再灌注损伤（ischemiareperfusion injury，I/RI）[1-5]。槲 寄 生[拉 丁 学 名：Viscum coloratum（Kom.）Nakai]是我国的传统中药，对心血管系统具有一定的保护作用[6-7]。远程缺血后适应（remote ischemic post-conditioning，RIPOC）是近年提出的减少器官组织I/RI的比较新的理论和方法，RIPOC操作无创、简单易行，有潜在的临床应用价值[8-12]。本研究通过建立大鼠I/RI的模型，将槲寄生有效提取物和RIPOC联合应用，探究两种干预措施对I/RI心肌的保护作用及机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物

健康成年雄性SD大鼠50只，8～10周龄，体重250～300 g，牡丹江医学院实验动物中心提供，动物合格证号 SYXK（黑）2019-006。实验过程严格按照动物伦理要求处置实验动物。

1.2 药品、试剂与仪器

槲寄生有效提取物的制备方法见文献[13]。10%水合氯醛（300 mg/kg，上海山浦化工有限公司），CK试剂盒、CK-MB试剂盒、LDH试剂盒（南京建成生物工程生物公司）。BL-420E多功能生物信号采集系统、HX-100E小动物呼吸机（成都泰盟科技有限公司）。

1.3 建立心肌缺血再灌注损伤（I/RI）模型

10%水合氯醛（300 mg/kg）腹腔麻醉SD大鼠，仰卧位固定。连接BL-420E多功能生物信号采集系统，持续监测心电图（electrocardiogram，ECG）Ⅱ导联及心率（HR）变化。颈胸部备皮，消毒，行气管插管术，连接小型动物呼吸机进行人工通气。

左侧胸前术区沿第4肋骨向腋窝走行方向切开皮肤，钝性分离肋间肌层2～3 cm，进入胸腔，迅速将心脏挤出胸腔，识别冠状动脉左前降支（left anterior descending，LAD），并用 6-0不可吸收缝合线将其结扎。缝线打结时放置一根“10”号丝线协助压迫造成心肌缺血，30 min后剪断线结行再灌注 120 min。I/RI模型成功的标准：心电图ST段抬高和（或）T弓背向上，左室前壁颜色逐渐变白，表示造模成功。

1.4 分组及干预给药

50只SD大鼠 随机分为5组，每组各10只：①Sham组：LAD下方穿线不结扎，连续观察 150 min。②I/RI组：冠脉结扎30 min后再灌注 120 min。③槲寄生组：灌胃给予槲寄生有效提取物（300 mg/kg），1 次 /d，连续14 d，最后一次结束后结扎冠状动脉，30 min后剪断丝线复灌120 min。④RIPO组：冠状动脉结扎30 min后，对大鼠左后肢使用止血带做3周期5 min缺血/5 min 再灌注处理，然后复灌120 min。⑤联合组（槲寄生+RIPOC组）：每日灌胃给药同槲寄生组，最后一次结束后结扎冠状动脉造成心肌缺血30 min后，再进行RIPOC干预，最后复灌120 min。Sham组、I/RI组与 RIPOC 组灌胃等量0.9%氯化钠溶液，均持续干预 14 d。

1.5 观察指标

监测血流动力学及ECG变化：全程监测并记录开胸前基础值（T0），缺血10min（T1），缺血30 min（T2），再灌注30 min（T3），再灌注60 min（T4），再灌注120 min（T5）不同时间段的HR和平均动脉压（MAP）。

血清生化指标测定：再灌注120 min后，静脉采血1～2 ml，置于抗凝试管并静置室温20 min后，离心机上3500 转/min，离心10 min后吸取上清血清置入灭菌离心管中，并保存于-20℃冰箱中，测定血清血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）、肌酸激酶心肌型同工酶（creatine kinase isoenzyme MB，CK-MB）、乳酸脱氧酶（iactic dehydrogenase，LDH）含量。

心肌梗死程度：收集血液标本后，迅速打开胸腔再次结扎LAD，经颈内静脉注入1%伊文氏蓝1～2 ml染色（正常心肌被染成蓝色，缺血心肌不着色）。3 min 后将心脏剪下，-20℃冰箱冰冻1 h后，切成1.0～2.0 mm厚的薄片，置于1% TTC中，37℃温育 30 min。其中白色部位表示心肌梗死区（infarct size，IS），红色和白色代表心肌缺血区（area at rist，AAR），蓝色表示正常心肌组织即非缺血区，LV代表左心室（left ventricle，LV）。吸干水分后称取各区重量。缺血程度用缺血区重量/左心室重量（AAR/LVg）表示；梗死程度用梗死区重量/缺血区重量（IS/AARg）表示。

1.6 统计学处理

所有资料均采取SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以（）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间点HR的比较

I/RI组与各干预组大鼠的HR随时间推移均有所下降（P＜0.01）。T1至T5时刻，与 Sham 组比较，I/RI 组HR降低明显（P＜0.01）；与I/RI 组比较，T2至T5时刻，各干预组HR相对较高（P＜0.05，P＜0.01）；T3至T5，联合组大鼠的HR高于槲寄生组和RIPOC组（P＜0.01）。见表 1。

2.2 各组大鼠不同时间点MAP的比较

T2至T5时刻，与 Sham 组比较，I/RI组血压明显下降（P＜0.01）；与 I/RI组比较，T2至T5时刻，各干预组大鼠血压相对较高（P＜0.01）。T3至T5时刻，联合组大鼠的血压高于槲寄生组和RIPOC组（P＜0.01）。见表2。

表1 各组大鼠不同时间点的HR比较（±s，次/min）

表1 各组大鼠不同时间点的HR比较（±s，次/min）

注：与Sham 组比较，aP＜0.01；与I/RI组比较，bP＜0.05，cP＜0.01；与联合组比较，dP＜0.01

组别 n T0 T1 T2 T3 T4 T5 F值 P值Sham 组 10 386±9 380±4 391±10 390±6 388±11 382±3 2.347 ＞0.05 I/RI组 10 389±12 364±10a 361±3a 358±2a 361±8a 339±9a 29.480 ＜0.01槲寄生组 10 388±11 362±10 362±3b 370±4cd 368±5bd 356±4cd 17.460 ＜0.01 RIPOC组 10 387±11 362±7 365±4b 372±7cd 369±6bd 358±8cd 14.744 ＜0.01联合组 10 386±9 361±4 368±8b 383±11c 377±5c 370±4c 13.159 ＜0.01 F值 0.169 34.975 11.109 32.509 19.451 73.917 P值 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表2 各组大鼠不同时间点的MAP比较（±s，mmHg）

表2 各组大鼠不同时间点的MAP比较（±s，mmHg）

注：与Sham 组比较，aP＜0.01；与I/RI组比较，bP＜0.01；与联合组比较，cP＜0.01

组别 n T0 T1 T2 T3 T4 T5 F值 P值Sham 组 10 104±5 106±3 105±6 103±3 101±5 100±6 2.087 ＞0.05 I/RI组 10 107±3 108±2 96±4a 75±3a 77±4a 65±3a 270.607 ＜0.01槲寄生组 10 105±4 110±3 100±3b 90±3bc 82±3bc 79±2bc 125.216 ＜0.01 RIPOC组 10 105±4 110±3 101±4b 88±5bc 85±4bc 82±3bc 71.578 ＜0.01联合组 10 106±3 109±4 100±3b 95±3b 93±3b 88±5b 36.603 ＜0.01 F值 0.867 1.913 4.527 62.997 60.901 87.527 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

表3 各组大鼠再灌注120 min后血清酶浓度比较（±s，U/L）

表3 各组大鼠再灌注120 min后血清酶浓度比较（±s，U/L）

注：与Sham 组比较，aP＜0.01；与I/RI组比较，bP＜0.01；与联合组比较，cP＜0.01

组别 n CK CK-MB LDH Sham 组 10 1033.52±72.77 192.55±28.40 312.79±29.82 I/RI组 10 12937.55±746.66a 1238.35±105.18a 1977.35±137.36a槲寄生组 10 8138.75±86.69bc 753.45±67.58bc 1105.72±83.56bc RIPOC组 10 8235.70±178.14bc 789.33±62.71bc 1059.13±59.35bc联合组 10 6371.14±187.34b 592.35±42.60b 785.32±26.40b F值 1297.481 320.565 536.036 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 各组大鼠血清生化指标的比较

与Sham组比较，I/RI组大鼠血清酶CK、CK-MB、LDH浓度均升高明显（P＜0.01）。与I/RI组比较，各干预组大鼠的三种血清酶浓度均有所降低（P＜0.01）。联合组大鼠的血清酶浓度低于槲寄生组和RIPOC组（P＜0.01）。见表3。

2.4 各组大鼠心肌缺血程度和梗死程度的比较

各组大鼠的心肌缺血程度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与I/RI组比较，各干预组大鼠的梗死程度均明显降低（P＜0.01）。联合组梗死程度小于槲寄生组和RIPOC组（P＜0.01）。见表4。

表4 各组大鼠缺血程度和梗死程度比较（±s，%）

表4 各组大鼠缺血程度和梗死程度比较（±s，%）

注：与I/RI组比较，aP＜0.01；与联合组比较，bP＜0.01

组别 n 缺血程度 梗死程度Sham 组 10 - -I/RI组 10 57.15±0.16 55.07±0.37槲寄生组 10 56.97±0.31 45.47±0.37ab RIPOC组 10 56.89±0.68 43.25±0.21ab联合组 10 56.87±0.61 18.64±0.34a F值 0.684 22231.041 P值 ＞0.05 ＜0.01

3 讨论

槲寄生是我国传统常用中药材[14-17]，其对心血管系统的作用已成为研究热点。RIPOC作为一种非药物治疗方法，在冠脉溶栓、心脏手术等领域有巨大的临床应用价值[18-19]。结果显示，在T2至T5时刻，与I/RI组相比，槲寄生、RIPOC或者二者联合干预下，都能改善I/RI大鼠的HR，还可以平稳血压，联合组效果优于槲寄生组和RIPOC组。

CK-MB、CK、LDH 的血清浓度常作为心肌I/RI的诊断性标志物，用来评价心肌细胞损伤程度[20-23]。结果显示，I/RI组的 CK-MB、CK及 LDH浓度较缺血前明显升高，说明I/RI对大鼠心肌细胞产生了严重的损伤；再灌注 120 min后，与I/RI组相比，槲寄生组和RIPOC组的CK、CK-MB及LDH 浓度明显降低，均可减轻心肌细胞的损伤和坏死，联合组大鼠的血清酶浓度明显低于槲寄生组和RIPOC组。

心肌梗死程度的测定是评估心肌各种干预措施是否有效的重要标准之一。与 I/RI组相比，槲寄生、RIPOC都能减轻心肌细胞的损伤，心肌梗死程度明显减少，联合组梗死程度最轻，明显小于槲寄生组和RIPOC组。

综上所述，槲寄生和RIPOC两种干预方式联合应用，可以最大程度改善I/RI心肌的血流供应，减少心肌酶的释放，减少再灌注后心肌损伤，具有一定的协同保护作用。