胃癌中eIF4A1表达特征及其在胃癌细胞增殖中的作用

韩芳芳

黄河水利委员会黄河中心医院，河南省郑州市 450000

胃癌是起源于胃壁黏膜上皮的恶性肿瘤，它的发病率处于消化道恶性肿瘤的首位[1]。大部分胃癌发现时癌变组织已经弥散浸润超过黏膜下层，属于中晚期胃癌的范畴，此时患者已错过实施根治性手术的黄金时期[2]。且化疗带来的不良反应严重降低患者生活质量，不利改善预后。因此，寻找新型的治疗方案来提高治疗有效率以及患者的生存率是当务之急。当前，使用阻断剂对肿瘤发生发展有紧密联系的信号传导通路进行阻断，继而实现抑制肿瘤增殖生长、侵袭及转移是肿瘤治疗的热点之一。有研究表明，真核起始因子4A1(eIF4A1)表达特征与胃癌细胞的转移有密切联系[3]。也有研究显示，eIF4A1能有效结合Silvestrol，继而影响eIF4A1的活性，但是针对胃癌的此类报道甚少[4]。基于此，本研究探讨胃癌中eIF4A1表达特征及其在胃癌细胞增殖中的作用，具示如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选择2016年10月—2019年10月我院收治的61例胃癌患者，收集其胃癌组织以及相对应的癌旁正常组织制作标本，直径为0.5cm，用10%甲醛固定。胃癌及相应癌旁正常组织标本均经过病理学诊断确诊。患者均知情并签署同意书，本研究经过医学伦理委员会批准。

1.2 方法 (1)材料准备：准备SGC-7901细胞、eIF4A1、SP免疫组化试剂盒、Silvestrol。(2)eIF4A1检测：采取免疫组化法。将胃癌组织及癌旁正常组织均切成厚度4μm的切片，置于防脱玻片上，于67℃温度下烤片2h。进行脱蜡和水化，将切片放入装有沸腾的抗原修复液的烧杯中，保鲜膜封闭烧杯口，将烧杯沸水浴15min 后取出自然冷却至室温，完成抗原修复。PBS清洗3遍后，使用3%过氧化氢浸泡10min；使用5%马血清室温封闭30min。滴入1∶300稀释的一抗eIF4A1工作液，于37℃温度下孵育2h，使用PBS缓冲液替换一抗做阴性对照，孵育2h。用PBS 缓冲液冲洗3次。滴入1∶500的生物素标识二抗稀释工作液孵育。加入DAB溶液后在显色液显微镜下观察，并使用蒸馏水清洗来结束反应。使用苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水浸泡蓝化，然后脱水、封片。免疫组化评分方法[5]：染色强度与染色区域的乘积。染色强度分数：阴性0分，弱阳性1分，中等阳性2分，强阳性3分；染色区域分数：<5% 0分，5%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分。胃癌组织和相对应癌旁正常组织评分结果：0～7 分是低表达，8～12分是高表达。(3)SGC-7901细胞增殖活性及活细胞计数检测：采用CCK-8法。从-80℃超低温冰箱中取出SGC-7901细胞，放于37℃水浴箱中解冻。取出细胞冻存管，喷洒75%酒精后放入操作台。打开内含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，取出4ml放于15ml离心管中，打开冻存管用3ml一次性滴管将细胞移入含4ml培养基的离心管中，充分打匀。将内含细胞悬浊液15ml离心管进行离心处理，结束后除去上清液，加入含10%的培养基3ml反复轻柔吹打至混匀于培养液中，过火细胞培养瓶并打开盖子，水平放置细胞培养瓶，用滴管吸取含10%胎牛血清的RPMI1640培养基置入细胞培养瓶中，然后再加入离心管中的细胞混液，摇匀。酒精灯过火瓶口及瓶盖后盖好细胞培养瓶，然后将其放于5%CO2、37℃的培养箱中培养直至对数生长期。将各组SGC-7901细胞放于75cm2细胞培养瓶中长到90%，上述操作离心除去上清液后加入10%胎牛血清的RPMI1640培养基3ml，混匀后将10μl该细胞混液移入含10μl染料的PCR管中，混匀后将10μl混滴液滴到细胞计数板上，用Countess Ⅱ FL细胞计数仪测定每组活细胞数计数。根据计数结果，用细胞培养基将各组细胞浓度调整为4×104个/ml。96孔板，100μl/孔，3个复孔每板每组，设5个板。将含120μg/ml的Silvestrol(于DMSO溶剂溶解)100μl细胞培养液作为药物组；将0.5%DMSO的100μl细胞培养液作为对照组。两组孔板均放在5%CO2、37℃恒温培养箱中进行孵育作常规培养。2d后将孔中原培养液洗净，加90μl无血清培养基，检测前加入CCK-8溶液10μl/孔，置恒温培养箱中反应1h后，检测450nm波长处吸光度值(OD值)表示细胞增殖能力。

1.3 评价指标 (1)免疫组化评分比较：统计并比较胃癌组织、癌旁组织中免疫组化评分。(2)eIF4A1表达比较：检测后，统计并比较胃癌组织、癌旁组织中出现高表达例数。(3)SGC-7901细胞增殖活性及活细胞数计数比较：培养后，比较药物组及对照组的OD值以及细胞计数。

2 结果

2.1 免疫组化评分比较 胃癌组织中免疫组化评分为(9.11±0.95)分，高于癌旁组织的(7.95±0.78)分，差异有统计学意义(t=7.371，P=0.000)。

2.2 eIF4A1表达比较 检测后，胃癌组织中eIF4A1高表达率为81.97%(50/61)，高于癌旁组织的14.75%(9/61)，差异有统计学意义(χ2=55.174，P=0.000)。

2.3 SGC-7901细胞增殖活性及活细胞数计数比较 培养后，药物组中SGC-7901细胞OD值及活细胞计数均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

3 讨论

良性肿瘤在发展为恶性的过程中，存在两个必备条件：(1)基因突变，即解除人体对于癌细胞生长的控制，使其能够无限繁殖；(2)肿瘤逃逸，即肿瘤细胞摆脱人体免疫系统的杀伤。但是人体系统具备识别异己的能力，肿瘤突变产生新的抗原会被免疫系统识别、杀伤。

表1 两组SGC-7901细胞增殖活性及活细胞数计数比较

患者在发现胃癌病灶时往往已发展到中晚期，此时化疗是主要治疗方法，但患者会因化疗产生严重的不良反应且耐药率居高不下[6]。当前，对肿瘤细胞特定靶点具有抑制作用的小分子靶向药物的应用不良反应较轻、耐药率低等优势较为明显，已经成为中晚期胃癌治疗的一种有效手段[7-8]。真核起始因子(eIF)是一个蛋白质编码基因，能够将核糖体聚集到mRNA中，产生预起始复合体。其中的eIF4A1是一种RNA解旋酶，能够对相邻的mRNA帽子周围的二级结构进行重塑，加速帽子依赖的mRNA翻译。但是在翻译的过程中避免不了出现失控翻译。有研究表明，eIF4A1的过分表达会造成基因翻译图谱出现改变，和癌症的恶性表型有着密切的关系，影响患者癌症的进展与转移[9]。对癌细胞内失控的翻译进行有效控制能够有效抑制癌细胞的增殖。SGC-7901细胞是胃癌细胞中的一种，该细胞能够成功移植在免疫抑制的动物腹腔及皮下，是一种临床应用范围较广的细胞模型[10-11]。本研究结果显示，检测后胃癌组织中eIF4A1高表达率高于癌旁组织，表明胃癌细胞中eIF4A1表达量高于癌旁细胞。有研究表明，Silvestrol是一种从植物中提取的抑制剂药物，能够和eIF4A1进行高效的结合，继而对eIF4A1基因的活性产生抑制作用[12-13]。本研究结果显示，培养后，药物组中SGC-7901细胞OD值及活细胞计数均低于对照组，表明eIF4A1能有效结合Silvestrol，继而影响eIF4A1的活性以及增殖能力。分析原因可能是Silvestrol作为一种抑制剂类药物能够有效降低阻断SGC-7901细胞的信号传导通路，继而降低eIF4A1的活性，实现对肿瘤增殖生长的有效抑制[14-15]。

综上所述，胃癌细胞中eIF4A1表达量高于癌旁细胞，eIF4A1能有效结合Silvestrol，继而影响eIF4A1的活性以及增殖能力。