氧化锆表面结构化对成纤维细胞活力的影响

何新凤 何新珍

1 暨南大学附属惠州口腔医院·惠州口腔医院，广东省惠州市 516000；2 惠东县何新珍口腔诊所口腔科

牙齿缺失常见于老年人，不及时治疗者可影响咀嚼功能及面部美观度，严重者影响患者正常心理生理功能及日常生活质量。目前，临床上牙列缺损、缺失者常采用口腔种植技术修复牙齿。随着口腔医疗技术的发展，口腔种植牙齿的技术发展愈来愈成熟，其在修复效果方面令患者相当满意。目前，种植体常用材料为钛，虽获得临床医师广泛认可接受，但其仍存在弊端，如钛本身颜色所致牙龈出现色素沉着、影响X线局部组织成像[1]。与钛相比，氧化锆等材料针对患者的需求顺势而生，凭借良好的生物相容性、机械性能、结构致密及美学性能等优势，获得患者及临床医师的广泛认同[2]。种植成功的关键在于两个方面，一为种植体与骨组织良好的结合，二为种植体与软组织良好的结合。研究发现[3]，袖口结构有利于种植体与牙槽骨结合，并抑制口腔内免受细菌的侵入，但其如何保障种植体的稳定性及生物学屏障作用仍需深入研究。多项研究证实[4-5]，种植体的基台穿龈部分与牙龈纤维之间的结合方式可影响人牙龈成纤维细胞(Human gingival fibroblast，HGF)的增殖等生物学活性以及种植体周围组织的封闭作用，其中HGF对保障种植体与软组织良好的结合有重要意义，因此笔者就氧化锆表面结构化对成纤维细胞活力的影响展开报道，旨在为临床提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 该研究制作12个氧化锆试件样品，直径约为15mm，厚度约为1mm的圆形瓷块，根据处理方式不同，将其分为对照组(6例)和研究组(6例)。牙龈组织选取我院口腔科2020年1—9月收治的患者，纳入标准：(1)均为牙周冠延长术者；(2)患者或家属知晓且签署知情同意书；(3)均经本院伦理委员会批准。

1.2 方法 使用电脑设计将氧化锆试件样品制作成圆盘状，直径约为15mm，厚度约为1mm。其中对照组的氧化锆试件样品表面无须处理，保持表面光滑即可；研究组的试件样品使用精细加工切片系统制作微沟槽，主轴转速控制为30 000r/min，步进为120μm，切割深度为15μm，切片厚度为60μm。将切除的牙龈组织置于含有3% 双抗(青霉素 300U/ml，链霉素300mg/L，Sigma 公司，美国)的杜氏伊戈尔培养基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM，Gibco BRL公司，美国)中保存备用。将牙龈组织置于杜氏伊戈尔培养基中浸泡3次，并剪成1mm×1mm×1mm的组织块，最后置入培养皿中。将培养皿置入二氧化碳培养箱(长沙长锦科技有限公司)中恒温培养2～3h，然后加入含有3% 双抗培养液，2～3d换培养液，继续置于二氧化碳培养箱中恒温培养到细胞生长面积为培养皿总面积的80%～90%，最后进行传代。将两组试件样品分别依次消毒、磷酸盐缓冲液冲洗3次，并使试件样品表面干燥，最后将试件置于24孔板中。将4～7代HGF的细胞密度调整为1×105个/孔，并接种于24孔板中，静置半小时，并加入含有3% 双抗的培养液。培养6、24、72、120h后，立即取出培养皿并检测不同时间段HGF增殖情况。

1.3 检测方法 表面粗糙度测量：对照组的每个试件样品均采用原子力显微镜(Cypher，美国)测量，每个试件随机测量5个线段，选取6个试件分别进行测量，记录并取其平均值。静态接触角测量：每个试件样品均采用接触角测量仪(布鲁克， 美国)测量，取1μl去离子水加入试件样品表面，待液滴稳定后使用接触角测量仪进行测量，每组测量6个试件样品，每个试件测量5次，记录并取其平均值。表面元素百分比测量：对照组的每个时间样品均使用能量色散X射线分析仪(蔡司，德国)测量表面元素情况。HGF增殖水平检测：HGF培养6、24、72、120h后，于不同时间点取出测定HGF增殖情况。使用磷酸缓冲液冲洗未黏附的细胞，冲洗3次，取出试件放入新的24孔板中，并加入DMEM培养基及50μl细胞增殖—毒性检测液。置入二氧化碳培养箱中恒温培养2h后接种于96孔板中，100μl/孔。使用酶标仪[赛默飞世尔(上海)仪器有限公司]测量450nm波长处的吸光值(A值)，每个试件测量3次，记录并取其平均值。

1.4 观察指标 (1)分析对照组的表面粗糙度、表面元素百分比以及研究组的沟槽尺寸；(2)比较两组的静态接触角；(3)比较不同时间点的成纤维细胞增殖水平。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0专业统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，并采用t检验，P<0.05 评价为差异具有显著性。

2 结果

2.1 对照组的表面粗糙度、表面元素百分比以及研究组的沟槽尺寸 对照组的表面粗糙度为(24.62±2.86)nm，表面元素主要为锆(51.63%)，其余包括氧、碳、钾等元素；研究组的沟槽宽度为(59.85±0.31)μm，沟槽顶宽度(59.74±0.29)μm，深度(9.93±0.78)μm。

2.2 两组的静态接触角比较 对照组的静态接触角为(67.73±5.24)°，明显高于研究组的(50.75±2.86)°,两组差异有统计学意义(t=6.967，P=0.000)。

2.3 不同时间点的成纤维细胞增殖水平比较 对照组于6、24、72、120h的成纤维细胞增殖水平明显低于研究组(P<0.01)，详情见表1。

表1 不同时间点的成纤维细胞增殖水平比较

3 讨论

自口腔种植技术引进应用于临床，随着医疗技术的发展，其在种植修复牙齿效果方面逐步扮演重要的角色。近几年，牙列缺失、缺损者广泛使用种植修复技术恢复牙齿正常咀嚼功能及牙齿的美观度。近几年，兴起的氧化锆材料凭借良好的美观性能及生物相容性广泛应用于口腔修复的各个领域。氧化锆属于生物惰性材料，具备稳定的化学性能，同时具备类似恒牙釉质的折光系数，可用于前牙变色的牙齿美学修复[6]。氧化锆作为前景应用最为广泛的全瓷材料，研究的热点多倾向于如何保障种植体与软组织更好的结合。保障良好的软组织封闭作用，有助于种植体免受微生物等细菌的侵蚀，同时保护种植体与骨组织结合[7]。

研究发现[8]，保障种植体与周围软组织良好的结合关键在于使HGF可以黏附增殖于氧化锆种植体表面。影响HGF附着增殖的因素颇多，如表面粗糙度、润湿性、表面形貌及表面化学成分等因素。既往大多研究认为[9]，光滑表面有利于HGF生长增殖，其实是细胞平行排列生长于光滑表面，并不利于其生长增殖。王丽波等人[10]报道，微粗糙表面通过增加HGF附着的面积，从而有利于HGF细胞黏附增殖；氧化锆表面经喷砂处理后可产生接触诱导现象，同时短时间内可以促进细胞黏附，提高HGF的黏附率。郑苗等人[11]报道，不改变氧化锆表面粗糙度及表面形态为前提下，通过增加氧化锆表面润湿性，可有利于HGF早期黏附增殖。赖颖真等人[12]报道，氧化锆表面经微沟槽处理后与氧化锆光滑表面相比，其可增加细胞附着的面积，进而促进HGF黏附增殖。同时微沟槽的结构可诱导细胞沿种植体垂直方向增殖生长，进而有利于软组织环绕种植体的基台穿龈部分，从而形成稳定的软组织边缘封闭结构。本文结果显示对照组的表面粗糙度为(24.62±2.86)nm，表面元素主要为锆、氧，对照组的静态接触角明显高于研究组；表明氧化锆表面的粗糙度、元素组成及润湿性与HGF黏附增殖有关，一定程度上来说，氧化锆表面微粗糙及提高表面润湿性有利于HGF早期附着增殖；对照组于6、24、72、120h的成纤维细胞增殖水平明显低于研究组，加以证实氧化锆表面采取结构化可增加细胞黏附的面积，有利于HGF在氧化锆表面黏附，其培养时间是否影响HGF生长增殖，仍需深入研究。

综上所述，氧化锆表面采取结构化通过增加细胞黏附的面积，有效诱导细胞沿种植体垂直方向生长，有助于形成稳定的软组织边缘封闭结构，同时提高HGF黏附增殖能力。