基于SSNNPP分子标记的玉米杂交种基因型分析与纯度鉴定

尹祥佳，李 晶，王雅琳，王剑虹，翟 琛，郝 楠，焦珍珍

（1.兰州职业技术学院 甘肃，兰州 730070；2.北京通州国际种业科技有限公司 北京 101100）

玉米(Zea mays L.)是我国第一大粮食作物，也是重要的饲料和工业加工原料[1-2]。中国报告网数据显示，我国2019年玉米播种面积达到4128万hm2，总产量达到2.6亿吨，玉米种植面积和总产量均为粮食作物之首，对保障我国粮食安全起到了关键作用。根据农业农村部统计数据，2019 年底我国玉米品种审定总数为14495 个，其中国审品种1978个，地方审定品种数12517个。

近些年，我国玉米制种产业的发展提供了丰富的玉米种植品种数量。甘肃省是国内重要的玉米制种地基，在河西走廊建有国家级的玉米种子生产基地。据相关文献报道[3]，2019 年全省有玉米种子企业130 家，玉米种子生产面积8.26万hm2，产种5亿公斤，面积和产量分别占全国玉米制种总面积和总产量的48%和51%。玉米种子质量是保障玉米种植业发展的重要生产资料，直接影响到玉米种植的产量和粮食品质。

随着分子生物学技术的发展，SNP分子标记技术已经应用于玉米种质资源的遗传背景和多样性分析、遗传图谱构建、品种真实性和纯度鉴定、分子辅助选择育种等方面。何冰纾等[4]应用SNP分子标记对陕单609的杂种优势模式进行了分析，对于玉米自交系的选育和组配提供了依据。郑德波等[5]利用SNP 对2 个F2:3 群体对株高和穗位高性状进行了分析，发掘出了一些新的株高和穗位高的QTL。吴金凤等[6]采用SNP 标记分析了51 份玉米自交系的基因型，并将其划分成了7 个杂种优势群，有效提高了玉米新品系的选育效率。覃嘉明等[7]应用SNP 构建玉米高密度遗传图谱，研究得出了控制玉米秃尖的主效QTL。李雪等[8]采用SNP 芯片检测技术研究了先玉335、郑单958和京玉7号等11份玉米杂交种的品种真实性，同时与SSR 荧光标记分析进行了比较研究。姚宗泽等[9]验证了SNP 检验玉米杂交种纯度的可靠性，扩展了玉米杂交种纯度的鉴定方法。因此我们选取6 份甘肃省内推广的玉米杂交种作为研究对象，应用LGC SNP 高通量基因分型检测平台（KASP 技术）开展玉米杂交种基因型分析与纯度鉴定研究，为我省乡村振兴战略背景下玉米制种品种质量监测提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在玉米种子市场购买了金穗1203、金穗4 号、武科8号、金艾130、方玉36和甘玉801等6份玉米杂交种作为试验材料。

1.2 SNP标记引物

利用Primer Express Software v3.0.1 软件设计扩增引物和分型探针，并由生物技术公司合成，SNP标记信息见表1。

表1 SNP标记信息

1.3 试验方法

1.3.1 基因组DNA提取 根据文献[10]的报道，采取改良的CTAB 法提取基因组DNA。DNA 质量和浓度用Nano-Drop2000(Thermo Scientific)紫外分光光度计进行测定，然后用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 质量，调节工作液浓度。

1.3.2 PCR 反应体系 PCR 反应体系配置在96 孔板中，反应体系为5µl，其中，DNA(50ng/µl)1µl，KASP Mix2.5µl，primer Mix0.1µl，ddH2O1.4µl。PCR 反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃复性60s，72℃延伸30s，35个循环后72℃终延伸10min，4℃Forever，复性温度根据不同引物进行调整。

1.3.3 玉米杂交种的SNP 基因型分析和纯度鉴定 每份杂交玉米种随机取96 粒种子作为检测样品，采取改良的CTAB法提取基因组DNA后用SNP标记引物分别进行PCR 反应，然后用LGC SNP 高通量基因分型检测平台读取数据。计算玉米杂交种的纯度公式为P（%）=(NT-ND)/NT×100，其中，P为种子纯度；NT供检种子数；ND杂交种子数。

2 结果与分析

2.1 玉米样品基因组DNA提取质量分析

用NanoDrop2000紫外分光光度计测定提取的玉米杂交种基因组DNA 浓度，并调节浓度为50ng/µl，然后用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，检测结果见图1，结果表明，提取的玉米基因组DNA质量适合PCR扩增。

2.2 SNP基因型分析与纯度鉴定结果

每份玉米品种随机选取96粒种子样品单独提取基因组DNA 作为PCR 扩增模板，分别用SNP 标记引物进行了基因型分析（图2）和纯度鉴定（表2）。等位基因的探针分别是VIC（绿色）和FAM（蓝色）。纯度鉴定值在95.83%-98.96%之间，符合玉米杂交种纯度的国家标准。

图1 玉米基因组DNA检测结果

图2 玉米品种的SNP基因型分析结果

表2 纯度鉴定结果

3 结论与讨论

随着基因组测序技术的发展，研究者开发了大量的玉米SNP标记位点，随着各种检测平台的推广使用，玉米品种的SNP 鉴定技术也在快速发展[11]。SNP 标记技术已经被国际植物新品种保护联盟（UPOV）推荐为农作物品种鉴定和指纹数据库的方法之一，主要有SNP芯片平台、样本高通量的原位扫描平台（LGC公司KASP技术，Life公司Taqman技术）、位点和样本高通量的靶向测序技术等，数据读取基于二等位变异和荧光检测系统[12-15]。

目前，SNP 分子标记技术作为第三代分子标记技术，应用于玉米杂交种纯度的鉴定成为重要的研究内容。SNP分子标记在玉米种子质量检测过程中具有一定的技术优势：一是具备高通量检测的技术支撑，二是标记位点在玉米10 条染色体上分布密度高且分布均匀，检测数据统计比较简单，软件直接读出试验结果；三是检测过程不需要聚丙烯酰胺凝胶电泳，所用试剂相比较SSR 标记的危害较小，符合绿色环保的要求。

SNP 分子标记相比较其它分子标记，在玉米基因型分析和品种纯度鉴定中的应用将更加广泛。我们采用SNP 分子标记中的KASP 技术对甘肃省内推广的6 份玉米杂交种进行了纯度鉴定，结果显示4对SNP引物均能准确的得出试验数据，纯度鉴定结果在95.83%-98.96%之间，说明了SNP 分子标记KASP 技术结果可靠，能够有效实现了高效率、高灵活性、简便快捷、低成本的检测技术优势，可以作为玉米杂交种纯度检测的新方法，并在今后基于SNP标记的玉米品种分子鉴定中发挥越来越重要的作用，能够有效为我省乡村振兴战略背景下玉米制种品种质量监测技术研究提供技术参考。