木槿花多糖改善Ⅱ型糖尿病作用机制研究

孟磊，张玉婷

(盘锦职业技术学院，辽宁 盘锦 124000)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是以碳水化合物、脂质和脂蛋白代谢异常为特点的严重慢性代谢性疾病，在临床上表现为高血糖，“三多一少”即多饮、多尿、多食和身体消瘦。据世界糖尿病联盟报道，2017年全球的糖尿病患者已达4.51亿，预计到2050年将超过7亿患者[1]。糖尿病主要有1型和2型(T2DM)，其中T2DM占糖尿病患者的90%以上，T2DM主要是由基因与环境共同引起的，胰岛素抵抗是其主要的病理机制[2]。此外，长期的高血糖会引起氧化应激系统异常[3-4]，引起一些糖尿病并发症[5]。市面上已有一些药物能起到降糖的作用，尽管这些药物(西药)在降糖方面作用明显，但长期服用，会引起一些不良反应，例如酮酸中毒、肥胖、低血糖、心血管疾病等[6]。因此，寻找一种新型安全有效，副反应小的降血糖药物已刻不容缓。

多糖是一类由酮糖或醛糖通过糖苷键连接而成的天然高分子聚合物，现代药理活性实验发现多糖具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、降血糖和降血脂等活性。研究发现，多种植物多糖不仅能降低体内的葡萄糖水平，而且还副作用少，作用靶点多，明显改善糖尿病的“三多一少”症状。

木槿花(flos hibisci)又名篱障花、鸡肉花，是锦葵科木槿属植物木槿(hibiscus syriacus L)的花。研究发现木槿花多糖(FHP)具有多种生物活性，例如清热利湿；凉血解毒，抗氧化等功效，但未见其降血糖活性报道。秋葵作为其同属植物，越来越多的研究发现秋葵多糖能通过抗氧化作用来改善Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病模型的降糖活性[7-8]，同属植物在药理方面有相同的活性。因此，本研究集中研究木槿花多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠模型在降血糖方面的作用及其潜在的降血糖的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6雄性小鼠80只，体重18～22 g，购自于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，合格证号SCXK-(吉)-2019-0002。

1.2 药物和试剂

木槿花于2018年9月采摘于浙江省资溪嵊泗县，经吉林农业大学中药材学院郑毅男教授鉴定为锦葵科木槿属植物木槿的花。

高脂饲料，上海睿时生物科技有限公司；链脲佐菌素(STZ)(批号：MB1227)(临用前溶于pH=4.5的柠檬酸钠缓冲溶液中配成 1% 的试液)和二甲双胍(批号：MB1927)，大连美仑生物技术有限公司；活性氧(ROS)(批号：E004-1-1)、丙二醛(MDA)(批号：A003-1-2)、超氧化物歧化酶(SOD)(批号：A001-3-2)、过氧化氢酶(CAT)(批号：A007-1-1)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)(批号：A005-1-2)、甘油三酯(TG)(批号：A110-1-1)、胆固醇(TC)(批号：A111-1-1)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)(批号：A113-1-1)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)(批号：A112-1-1)，磷酸化磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)(批号：A119-3-2)、磷脂酰肌醇激酶(PI3K)(批号：A119-3-1)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)(批号：A120-1-2)、蛋白激酶B (AKT)(批号：A120-1-1)、磷酸化糖原合成酶激酶-3(p-GSK3β)(批号：A118-2-2)、糖原合成酶激酶-3(GSK3β)(批号：A120-2-1)ELISA测试盒，南京建成生物工程研究所。其它分析试剂均购自于山东禹王试剂有限公司。

1.3 仪器

MK3酶标仪，美国Thermo Electron公司；KQ200-KQD型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；TGL-16M台式高速冷冻离心机，金坛市亿能实验仪器厂；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂。

2 方 法

2.1 试药的制备

2.1.1 FHP的制备

1.5 kg干燥的木槿花，粉碎，10倍量的水于75 ℃提取3次，每次2 h，合并提取液，离心。50 ℃旋至原体积的三分之一，采用Sevage法除去提取液蛋白，直至中间层无白色泡沫，加入无水乙醇至80%乙醇溶液，4 ℃过夜，离心弃去上清，收集沉淀，冷冻干燥，得FHP[9]。分别配成30、60、90 mg/mL的FHP溶液，备用。

2.1.2 二甲双胍的制备

取300 mg二甲双胍溶于蒸馏水中，浓度为20 mg/mL。

2.2 造模与给药

小鼠在适应性饲养5 d后，随机选取10只为对照组，给予正常饲料饲养，剩余70只小鼠，喂养高脂饲料8 w，于最后1 d禁食不禁水12 h，在第9周和第11周按100 mg/kg腹腔注射STZ，继续高脂饲养2 w，在最后1 d，禁食4 h后，测定小鼠尾静脉血糖值，测空腹血糖值≥11.1 mmol/L[10]，证明造模成功。造模成功后，50只小鼠随机分组，分别为模型组，二甲双胍组(200 mg/kg)，FHP低剂量组(300 mg/kg)、FHP中剂量组(600 mg/kg)、FHP高剂量组(900 mg/kg)，对照组和模型组每天定量给予生理盐水，连续给药16 w。

2.3 观察指标及测定

2.3.1 每隔4 w测定小鼠的血糖值、体重、水摄取量、食物消耗量。

2.3.2 葡萄糖耐受(OGTT)测试 在最后1次给药后，禁食不禁水12 h后，按2 g/kg给予葡萄糖溶液后0、30、60、90、120 min的血糖曲线下的面积，计算血糖曲线下的面积，计算公式如下：

AUC=0.5(G0+G30)×30+0.5(G30+G60)×30+0.5(G60+G120)×60。

Gi为各时间点的血糖值[11]。

2.4 TG、TC、LDL、HDL的测定

OGTT测试后，禁食12 h，将小鼠摘眼球取血，分离取肝脏和肾脏，冷冻离心分离血清，参照说明书测定血清中的TG、TC、LDL、HDL的含量。

2.5 ROS、MDA、SOD、CAT、GPX测定

按说明书的方法分别测定血清和肝脏中的氧化应激指标ROS、MDA、SOD、CAT、GPX。

2.6 p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-GSK3β、GSK3β ELISA测定

按说明书的方法测定肝脏中的p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-GSK3β、GSK3β指标。

2.7 统计学方法分析

3 结 果

3.1 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠血糖的影响

造模成功后，模型组与对照组相比，小鼠的血糖值增加(P<0.001)，药物组与模型组相比，给予二甲双胍8 w后，随着给药的时间增加，小鼠的血糖值显著性减少(P<0.05)，给予FHP中剂量12 w后，随着给药的时间增加，小鼠血糖降低(P<0.05)，给予FHP高剂量8 w后，随着给药的时间增加，小鼠的血糖值显著性降低(P<0.05)，差异具有统计学意义，见表1。

表1 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠血糖的影响

3.2 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠体重的影响

与对照组相比，造模成功后，模型组小鼠的体重显著性降低(P<0.01)，与模型组相比，给予二甲双胍16 w后，小鼠体重增加(P<0.01)，给予FHP高剂量12 w后，随着给药时间增加，小鼠体重增加(P<0.05)，见表2。

表2 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠体重的影响

3.3 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠水消耗量的影响

造模成功后，与对照组相比，模型组小鼠的喝水量会显著性增加(P<0.01)，与模型组相比，给予二甲双胍8 w后，随着时间的增加，小鼠的饮水量会减少，并趋于正常(P<0.05)，给予FHP中剂量和高剂量12 w后，随着时间的增加，小鼠的饮水量会减少，并趋于正常(P<0.05)，见表3。

表3 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠水消耗量的影响

3.4 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠食物消耗的影响

造模成功后，模型组小鼠的食物消耗会显著性增加(P<0.01)，与模型组相比，给予二甲双胍8 w后，小鼠的食物消耗减少(P<0.05)，给予FHP低剂量16 w后，小鼠的食物消耗减少(P<0.05)，给予FHP中剂量和高剂量12 w后，小鼠的食物消耗减少(P<0.05)，与对照组相比较无显著性差异(P>0.05)，见表4。

表4 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠食物消耗的影响

3.5 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠OGTT的影响

每组小鼠在口服给予葡萄糖30 min后，血糖值达到峰值，血糖值在30～60 min内缓慢降低，在60～120 min内血糖值快速降低，在120 min时二甲双胍给药组血糖值降到12.16 mmol/L，与模型组相比有统计学意义(P<0.001)；FHP高剂量组血糖值为9.29 mmol/L，与模型组相比有统计学意义(P<0.001)，见表5；FHP高剂量组和二甲双胍组的血糖曲线下面积AUC明显低于模型组，存在有统计学意义(P<0.05)。结果表明，FHP高剂量组能明显改善Ⅱ型糖尿病模型小鼠的葡萄糖耐受，并能快速降低餐后血糖，甚至好于二甲双胍组，见图1。

表5 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠OGTT的影响

与对照组比较：###P<0.001；与模型组比较：*P<0.05，***P<0.001

3.6 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠血清中TG、TC、LDL、HDL的影响

与对照组相比较，模型组血清中的TG、TC、LDL水平明显升高，而HDL水平则降低，存在有统计学差异(P<0.01)，与模型组相比，二甲双胍和FHP高剂量会明显降低血清中的TG、TC、LDL水平(P<0.01)，升高HDL水平(P<0.01)，而FHP低剂量和FHP中剂量对血清中的TG、TC、LDL、HDL水平无显著影响(P>0.05)。结果表明，FHP能明显改善Ⅱ型糖尿病小鼠的高血脂症，见表6。

表6 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠血清中TG、TC、LDL、HDL的影响

3.7 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠血清和肝脏中ROS、MDA、SOD、CAT、GPX影响

与对照组相比，模型组血清和肝脏中的ROS和MDA水平会显著性升高(P<0.01)，SOD、CAT、GPX水平则会降低(P<0.01)，而二甲双胍、FHP中剂量、FHP高剂量则会降低血清和肝脏中ROS和MDA的水平(P<0.01)，升高血清和肝脏中的SOD、CAT、GPX水平(P<0.01)，见表7。

表7 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠血清中ROS、MDA、SOD、CAT、GPX的影响

表8 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠肝脏中ROS、MDA、SOD、CAT、GPX的影响

3.8 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠肝脏中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-GSK3β、GSK3β的影响

各组PI3K、AKT、GSK3β均无显著性差异(P>0.05)，与对照组相比，模型组p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β水平会明显降低(P<0.01)，与模型组相比，二甲双胍、FHP中剂量、FHP高剂量均能升高p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β的水平(P<0.05)，FHP低剂量组对p-PI3K、p-AKT、p-GSK3β无显著影响(P>0.05)，见表9。

表9 FHP对Ⅱ型糖尿病小鼠肝脏中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-GSK3β、GSK3β的影响

4 讨 论

Ⅱ型糖尿病是一种由于胰岛β细胞功能部分受损而引起糖、脂、蛋白代谢异常引起的内分泌紊乱疾病。中医称糖尿病为消渴症，是由高脂高糖的饮食习惯所诱发，燥热内盛、气阴两亏为其主要病机[12]。在本实验中，采用高脂高糖饮食结合注射低剂量的STZ诱导Ⅱ型糖尿病模型，再分别给予二甲双胍和不同剂量的FHP进行治疗。结果表明，与模型组相比较，FHP中、高剂量会降低Ⅱ型糖尿病小鼠的血糖值、食物消耗量和水的摄取量，增加Ⅱ型糖尿病小鼠的体重，改善Ⅱ型糖尿病小鼠的消渴状况；对Ⅱ型糖尿病小鼠口服葡萄糖耐受有所改善，降低AUC面积；显著性降低小鼠血清中的TG、TC和LDL水平，增加HDL水平，改善Ⅱ型糖尿病小鼠的脂质代谢。因此，FHP能改善小鼠的肥胖、血脂紊乱，可能通过调节血脂来发挥降糖的作用，具体作用机制需要进一步的研究。

GSK3β是胰岛素受体后信号蛋白。在正常情况下，胰岛素通过使GSK3β磷酸化是其失活，失活的GSK3β会促进肝糖原的合成，降低血糖水平。在Ⅱ型糖尿病状态下，机体会出现胰岛素抵抗，使得脱磷酸化的GSK3β增多，肝糖原合成减少，会导致血糖水平的上升[13]。肝脏的PI3K/AKT信号通路是肝脏中调控GSK3β活性最重要的通路[14]。在本实验中，我们发现与模型组相比，给药后会激活PI3K/AKT信号通路，增加GSK3β的磷酸化水平，促进肝糖原的合成，减少血糖水平。

磷酸化的GSK3β除了能促进肝糖原的合成之外，还能进入细胞内，促进核转录因子Nrf2的转运，增加抗氧化酶的表达，清除多余的自由基，缓解氧化应激水平。在本实验中，模型组能明显增加ROS、MDA的水平，降低抗氧化酶SOD、CAT和GPX的活性，而二甲双胍和FHP能降低ROS、MDA的水平，增加抗氧化酶SOD、CAT和GPX的活性。

综上所述，木槿花多糖通过降低Ⅱ型糖尿病模型小鼠血清中的TG、TC和LDL水平，升高HDL水平来改善小鼠的高血脂症状对Ⅱ型糖尿病模型发挥有效作用，除此之外，木槿花多糖还能通过调控肝脏的PI3K/AKT/GSK3β信号通路，改善肝糖原代谢和氧化应激水平，进而发挥降血糖的作用。