姜黄素对佐剂关节炎大鼠趋化因子受体-7表达的影响

张佳，高微，袁红霞，柴文戍

(锦州医科大学附属第一医院，辽宁 锦州 121000)

类风湿关节炎[1](rheumatoid arthritis，RA)是一种慢性全身性自身免疫性疾病，具有一定的种族差异，发病与感染、遗传、内分泌、环境及吸烟等综合因素尤为相关。RA发病机制尚未完全清楚，尽管过去20年RA治疗取得了很大的进展[2]，但临床上仍然缺乏特异性的治疗措施，因此，研究RA的发病机制、探索其早期疗效及病情预后、寻找有效的治疗靶点，已成为医学界的当务之急。

多种趋化因子及其受体在RA滑膜组织中异常增高，提示趋化因子及其受体参与滑膜的增生过程，驱使特定的炎症细胞游走至炎症部位，参与炎症反应。在RA患者的滑膜组织和血管内皮细胞中，趋化因子受体-7(CC-chemokine receptor 7，CCR7)及其配体高度表达，调节RA患者的血管新生[3]，并形成血管翳，引起骨、软骨和关节的破坏，导致不可逆的关节功能丧失。故而CCR7受体在RA的发生发展中起到不可忽视的作用。

姜黄素(curcumin，CUR)是姜黄最具活性的成分，具备多种作用，包括抗炎、抗肿瘤、抑制血管新生等[4]。因为血管翳形成是RA重要的病理特征，故推测姜黄素具有抗类风湿的作用，但机制尚不清楚。本研究拟通过分子生物学和组织学方法，研究AA大鼠血清和关节滑膜中CCR7的表达，探讨姜黄素对AA大鼠的治疗作用及可能的机制，为临床治疗提供新方法。

1 材料及方法

1.1 材料

40只SPF级Wistar大鼠，雌性，体重160～180 g，由锦州医科大学实验动物中心提供(使用许可证书编号：SYXK(辽)2014-0002)；姜黄素、甲氨蝶呤、完全弗氏佐剂、兔抗大鼠CCR7多克隆抗体、Rat CCR7 ELISA Kit等分别由Sigma公司、Chondrex公司、通化茂祥制药有限公司和北京博奥森生物技术有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分组

将40只Wistar大鼠适应性饲养1 w后，随机选取9只，作为对照组(A组)，其余31只均建立AA模型，实验第7天时选取27只关节炎指数评分>2的大鼠随机分为3组，进一步分为模型组(B组)、甲氨蝶呤(C组)以及姜黄素组(D组)，每组9只大鼠。

1.2.2 模型建立及实验给药

使用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉大鼠，固定在操作台上，于左足底碘伏常规消毒，将10 mg/mL完全弗氏佐剂(CFA)于B、C、D组大鼠左后足底皮内注射，每只0.1 mL，制成AA模型，记为day 0。将等剂量生理盐水注入对照组大鼠左后足底皮内。于实验第7 d开始给药，C组和D组大鼠采用腹腔注射方式给药，其中C组：甲氨蝶呤注射液0.5 mg/kg(治疗RA经典药物作为阳性对照，依据蔡佳宇等人文献[5]选择最适剂量)，3 d给药1次，连续给药21 d(7次)；D组：姜黄素注射液50 mg/kg(依据预实验结果选择最适剂量)，每日1次，共使用21 d。将等剂量生理盐水分别腹腔注入模型组和对照组大鼠。

1.2.3 标本处理

于最后一次姜黄素治疗后24 h，即实验第28天，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 mL/100 g)，麻醉后固定大鼠，迅速抽取右心室静脉血，于离心机以3000 r/min的速度离心15 min，移取上清液保存于-20 ℃冰箱，用于CCR7蛋白的测定。

取大鼠左后足连同踝关节一起，去除皮毛和肌肉，冲洗干净，在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，使用脱钙液脱钙，每克组织约需脱钙液30 mL，每7天换液1次，常规脱钙2 w，直至大头针针刺组织无抵抗时为止。脱钙满意后，纵行剖开关节，常规酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。

1.2.4 Western blot法(免疫印迹法)检测AA大鼠滑膜组织PI3K、AKT、VEGF蛋白表达

制备蛋白提取液，BCA法蛋白定量，配置SDS-聚丙烯酸胺凝胶：浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为10%。按每孔蛋白含量(50～100 μL)相同的原则，于浓缩胶的上样孔中，加入蛋白上样液，剥离凝胶，转膜，封闭，分别滴加一抗，于4 ℃孵育过夜，用显色液显色，最后用ImageJ软件行灰度值分析，以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.2.5 ELISA法检测AA大鼠血浆中CCR7、PI3K、VEGF的表达

根据ELISA试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 姜黄素对AA大鼠体征及踝关节肿胀程度的影响

A对照组大鼠一般状态良好，饮食正常，毛发光泽，活泼好动，精神状态佳，体重上升趋势，外观形态增大；关节无红肿。B模型组大鼠于实验后出现鼠爪红肿，且肿胀程度随时间进展逐渐加重，以踝关节及后足最为明显。于第8～9天肿胀最严重，以踝关节为主，皮温升高，皮肤充血红肿，足垫增厚明显，部分鼠爪关节皮肤出现明显破溃现象；第21天起肿胀趋于平稳，进一步出现关节强直、不可负重现象。给予药物治疗后，C、D组大鼠仍精神萎靡、食欲差毛发枯燥并伴有脱毛等症状，但于实验第9、10天起有饮食水量逐渐恢复好转，精神状态有所好转，大鼠治疗后关节肿胀、皮肤充血情况有所减轻，尚未出现关节强直征象。于造模前使用排水法测量鼠爪体积，并每周记录鼠爪肿胀体积，于各时间段，B、C、D组鼠爪肿胀体积均高于A组；第14天，C、D组鼠爪肿胀体积较比B组减小(P<0.05)，明显高于A组(P<0.01)；第21天和第28天，C、D组鼠爪肿胀体积较比B组明显减小(P<0.01和P<0.05)，但C及D组无显著差异(P>0.05)，见表1、图1。

表1 姜黄素对AA大鼠爪体积变化的影响

与A组比较，##P<0.01；与B组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2 姜黄素对AA大鼠踝关节滑膜组织病理学改变的影响

根据关节组织病理切片的HE染色可见：A组大鼠关节腔清晰完整，关节间隙正常，关节滑膜无增生，无炎性细胞浸润，软骨表面光滑，未见血管增生现象，无软骨及骨质破坏。B组大鼠滑膜增生混乱，关节滑膜层明显增厚，滑膜中有大量炎性细胞及巨噬细胞浸润，细胞排列稀疏，可见部分血管翳形成，软骨及骨表面有严重的骨破坏。C组及D组大鼠可见滑膜增生，但程度明显低于B组。关节滑膜层有增厚，较比B组减轻，滑膜中少量炎细胞浸润，未见血管翳，未见明显的软骨及骨破坏，见图2。

A 对照组：关节腔清晰完整，关节间隙正常，滑膜无增生；B 模型组：关节滑膜明显增厚，大量炎细胞浸润；C 甲氨蝶呤组：关节滑膜轻度增厚，少量炎细胞浸润；D 姜黄素组：关节滑膜有增厚，少量炎细胞浸润

2.3 姜黄素对AA大鼠血清中CCR7蛋白含量的影响

在上述研究基础上，进一步通过ELISA方法对AA大鼠血清中CCR7、蛋白含量进行检测。结果显示，与A组比较，B、C、D组的CCR7蛋白含量均有明显升高(P<0.01)；与B组比较，C、D组蛋白表达明显下降(P<0.01)；C、D组比较无差异。AA大鼠血清CCR7蛋白含量增加，姜黄素能明显抑制CCR7蛋白含量，见表2、图3。

表2 姜黄素对AA大鼠血清中CCR7蛋白含量的影响

与A组比较，##P<0.01；与B组比较，**P<0.01

2.4 姜黄素对AA大鼠滑膜组织CCR7蛋白表达的影响

为探讨AA大鼠滑膜组织CCR7蛋白的表达及姜黄素对其表达的影响，通过Western blot方法检测CCR7蛋白表达。结果显示，与A组比较，B、C、D组CCR7蛋白表达均有显著增加(P<0.01)；与B组比较，C、D组蛋白表达明显下降(P<0.01)；C及D组相比无差异(P>0.05)。AA大鼠滑膜组织CCR7蛋白表达增加，姜黄素能明显抑制CCR7蛋白表达，见图4。

与A组比较，##P<0.01；与B组比较，**P<0.01

2.5 大鼠血清中CCR7含量与鼠爪肿胀体积的相关性分析

明确AA大鼠炎症反应与鼠爪肿胀体积的相关性，进一步对AA大鼠血清中CCR7蛋白含量与鼠爪肿胀程度进行分析。结果显示，AA大鼠血清中CCR7蛋白含量与鼠爪肿胀程度呈正相关、高度相关，相关系数分别为r=0.8784(P<0.01)，CCR7是AA大鼠重要的炎性介质，参与AA的发病过程，见图5。

r=0.8784，P<0.01

3 讨 论

AA大鼠类风湿模型是公认的类风湿动物模型，其表现为局部关节炎和全身性炎症反应[6]。本实验通过使用佐剂经典途径建造大鼠的类风湿关节炎模型，并于不同时间点观察大鼠体征、体重、足趾肿胀程度及病理染色切片，结果表明模型组大鼠均可见精神萎靡、毛发枯燥、行动不灵活、后肢跛行、鼠爪肿胀甚至强直等表现，鼠爪体积和关节炎指数明显增高，同时HE染色可见有滑膜增生混乱、滑膜中炎细胞及巨噬细胞浸润、软骨及骨组织表面破坏等征象，与文献研究结果一致[7]。而姜黄素组能明显减轻大鼠踝关节肿胀程度，鼠爪肿胀体积和关节炎指数明显低于模型组，HE染色关节滑膜增生、炎性细胞浸润及软骨的损伤明显减轻。提示姜黄素减缓关节滑膜组织增生、炎性细胞浸润以及软骨的破坏损伤。

有研究表明，多种趋化因子及受体在RA滑膜组织中表达明显增高[8]，提示两者参与滑膜增生过程。其中，趋化因子受体CCR7可特异地与趋化因子结合，CCR7与其配体联合作用可介导多种免疫细胞的迁移，并参与自身免疫性疾病的发生和发展，而在静止的单核细胞、中性粒细胞表面则未有表达[9]。

1988年，Valente等人发现首个趋化因子CCL2后，趋化因子及受体的结构与功能、作用途径成为研究的热点话题。国内外研究表明，多种趋化因子及受体在RA滑膜组织中表达明显增高，提示两者参与滑膜增生过程。细胞因子-趋化性细胞因子间的相互作用可能在炎症性滑膜炎疾病的发生、发展及持续阶段均起着重要作用。其中，趋化因子受体CCR7可特异地与趋化因子结合，CCR7与其配体联合作用可介导多种免疫细胞的迁移，并参与自身免疫性疾病的发生和发展，而在静止的单核细胞、中性粒细胞表面则未有表达。提示，CCR7在RA中发挥重要作用。新近研究表明，CCL19、CCL21和CCR7在RA患者的滑膜组织和滑液中高表达，RA患者血浆中CCR7升高[10]，且在RA的滑膜中发现有异位的生发中心，并与疾病的严重程度相关[11]。

姜黄素(curcumin，CUR)是姜黄最具活性的成分，具备多种作用，包括抗炎、抗肿瘤、抑制血管新生等[4，12]1053-1064。因为血管翳形成是RA重要的病理特征，故推测姜黄素具有抗类风湿的作用，但机制尚不清楚。

我们应用Western blot和ELISA法分别检测AA大鼠滑膜组织及血清中CCR7的蛋白含量，结果显示模型组CCR7表达明显高于对照组，经甲氨蝶呤及姜黄素等进行药物治疗后，CCR7明显降低。进一步进行相关分析，结果显示AA大鼠血清中CCR7蛋白含量与鼠爪肿胀程度呈正相关、高度相关r=0.8784(P<0.01)，提示CCR7参与了类风湿关节炎的发病过程，同时姜黄素可以通过抑制CCR7对类风湿关节炎起到治疗作用。

综上所述，姜黄素在AA大鼠滑膜组织炎症的病理改变过程中有明显的抑制作用，证明了姜黄素对RA的滑膜炎症有较好的治疗作用。从而为姜黄素临床上治疗提供了实验和理论依据。