柿叶黄酮纳米脂质体的制备工艺优化*

霍元子，屈怀东，王连艳，徐世一，阎雪莹

（1.黑龙江中医药大学 药学院，黑龙江 哈尔滨150040；2.中国科学院过程工程研究所，北京100089）

柿叶为柿树科柿树属植物柿的新鲜或干燥叶[1]。由于柿叶中所含的黄酮类化合物（PLF）有明显的药理活性、确切的临床疗效，其在抗菌消炎、清热解毒、抗氧化、抗恶性肿瘤、抗心脑血管疾病等领域有广阔的应用前景。目前，以PLF为主要有效成分的中成药（脑心清片）已应用于临床[2,3]。由于其脂溶性较低，而脂质体作为给药载体能够有效地解决水溶性药物的脂溶性问题，提高药物跨膜转运的能力。卡波姆在较宽pH值范围内可以保持相对稳定且具有一定的生物粘附性，能够相对地延长药物在吸收位点的作用时间，从而改进口服药物的疗效[4]。本论文采用UV-Vis对柿叶中总黄酮进行测定，为研究制备新型柿叶黄酮脂质体（PLF-Lip）制剂提供理论基础，也为进一步探索应用于临床的新型纳米给药系统提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

UV9100CPC型紫外-可见分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司）；JEOL-2010型透射电子显微镜（日本岛津公司）；Nano-ZS90型激光粒度-电位分析仪（马尔文仪器有限公司）；Scientz-IID型超声波细胞破碎机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；MD-200-2型氮气吹干仪（天津恒奥科技有限公司）。

芦丁对照品（中国食品药品检定研究院 批号：100080-201610）；PLF提取物（西安开来生物工程有限公司，纯度≥80%）；大豆卵磷脂（国药集团化学试剂有限公司），胆固醇（国药集团化学试剂有限公司），卡波姆（北京迪马科技有限公司），壳聚糖（北京迪马科技有限公司），聚维酮（国药集团化学试剂有限公司），HAc等其他试剂为分析纯。

1.2 方法

UV-Vis是测定PLF最为简便高效的方法。由于本研究所采用的PLF（黄酮含量≥80%）还含有其他成分，为便于PLF的定量分析，选择芦丁作为指标性成分，测得的理化性质数据实际是芦丁的理化性质指标。

1.2.1 PLF-Lip的制备 精密称取处方量的脂质材料和PLF，置于茄型瓶中，加入一定量的无水乙醇使其完全溶解。将茄形瓶置于旋转蒸发仪上，于40℃、50r·min-1旋转除去无水乙醇至无醇味，通入2h N2，静置过夜，除尽有机物。加入适量去离子水和若干玻璃珠，水化2h，水化液依次经过0.45、0.22μm有机滤膜滤过即得。

1.2.2 处方设计与筛选 以PLF-Lip的EE%和DL%为评价指标,通过单因素考察药脂比、PC∶Ch的值（卵磷脂与胆固醇的质量比）、磷脂浓度（CPC）、水化介质的种类、水化介质的pH值5个因素对PLF-Lip EE%和DL%的影响,针对关键因素进行正交实验的优化[5]。

1.2.3 UV-Vis检测方法的建立

1.2.3.1 检测波长的确定 取对照品溶液和供试品溶液适量，以不含芦丁、PLF的溶液作空白溶剂，在200～600nm波长范围内进行扫描，记录最大吸收波长。如图1，对照品溶液、供试品溶液均在362nm位置有最大的吸收峰，参照2015版《中国药典》，最终检测波长确定为362nm[6]。

图1 芦丁对照品、PLF供试品的最大吸收波长Fig.1 Maximum absorption wavelength of rutin standard and persimmon leaf flavonoid sample

1.2.3.2 线性关系考察 取对照品溶液用95%乙醇稀释，配成浓度（C）为25.000、20.000、12.500、6.250、3.125μg·mL-1的5组芦丁对照品溶液，于362nm波长处测定吸光度（A）。并以C为横坐标，A为纵坐标进行线性回归，得方程：A=0.0281C+0.0150（R2=0.9992）。表明芦丁对照品在3.125～25.000μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好。方法学考察中结果均符合2015年版《中国药典》的相关规定。

1.2.3.3 含量测定 精密量取适量的供试品溶液，稀释适当倍数，利用UV-Vis在362nm处检测A，利用芦丁标准曲线计算浓度。结果表明，以芦丁计PLF提取物中总黄酮含量约为84.32%。

1.2.3.4 验证试验 按得出的最佳工艺处方平行制备3批PLF-Lip，测算的EE%分别为83.5%、85.2%、86.1%，RSD%结果为1.55%，说明优化的处方工艺可靠。

1.2.4 包衣PLF-Lip的制备

1.2.4.1 制备 在预试验中对包衣材料进行了筛选，选定卡波姆作为本次试验的包衣材料，将新鲜制备的PLF-Lip与等体积一定浓度的卡波姆溶液混合，45r·min-1磁力搅拌30min，再孵育30min。4℃冰箱中静置过夜，即得卡波姆包衣的PLF-Lip。

1.2.4.2 卡波姆浓度对相对包衣率（CR%）的影响配制0.0、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0g·L-1的卡波姆包衣液，制备6组不同浓度卡波姆包衣的PLF-Lip。稀释适当倍数于510nm处检测卡波姆包衣的PLF-Lip的吸光度（A），按照下式计算CR%。以10.0g·L-1卡波姆的包衣率计为100%，其他浓度的CR%见表4。

式中AL：PLF-Lip的吸光度；A10：10g·L-1卡波姆包衣脂质体的吸光度；AL和A10：固定值。

2 结果和讨论

2.1 单因素考察

通过单因素考察药脂比、PC∶Ch的值、水化介质的pH值、CPC和介质种类这5个因素，以EE%和DL%为评价指标，确定主要影响因素，再通过正交设计试验，以EE%为单一评价指标，确定最终的最佳优化处方。实验结果见图2。

确定药脂比为1∶20、PC∶Ch为10∶1、CPC=10mg·mL-1、水化介质的pH值为7.0，由于介质种类对两种指标的影响较小，且考虑到制剂成本，最终选择去离子水作为水化介质。

图2 单因素考察结果图Fig.2 Single factor investigation result chart

2.2 正交实验优化处方

2.2.1 因素与水平 通过单因素考察初步确定药脂比（A）、PC∶Ch的值（B）、水化介质的pH值（C）和CPC（D）这4个主要影响因素，为进一步整体分析这些因素对EE%的影响，正交设计优化处方工艺。且每组因素设置3个水平，见表1。

表1 因素-水平表Tab.1 Table of factor-level

2.2.2 结果分析 按正交表中的9组处方完成实验操作，正交试验设计与结果见表2，方差分析结果见表3。

各种因素对EE%的影响由大到小的顺序均为：B＞D＞A＞C，在实验所选的因素中，水化介质的pH值对EE%的影响作用最小，药脂比对EE%的影响作用最大。因此依据统计学分析结果，并兼顾药物稳定性和经济性原则，优化制备处方为B2D3A2C2。确定药脂比为1∶20、PC∶Ch=10∶1、CPC=15mg·mL-1，水化介质为pH值为7的去离子水。

表2 正交设计表及包封率结果（n=3）Tab.2 Orthogonal design table and encapsulation results（n=3）

表3 包封率的方差分析表Tab.3 Variance analysis table for encapsulation rate

2.3 包衣材料浓度的选择

表4 卡波姆浓度对CR%的影响（n=3）Tab.4 Effect of carbomer concentration on CR%（n=3）

实验数据显示，随着卡波姆浓度的增加，PLFLip的CR%升高。说明在PLF-Lip的外层包上了卡波姆衣层。稳定性考察实验结果中，在保证不改变物理稳定性、EE%的前提下，确定以5g·L-1的卡波姆溶液作为最终的包衣材料。

2.4 表征

2.4.1 外观及TEM观察结果（图3）按最佳工艺制备的卡波姆包衣的Oral-PLF-Lip，用肉眼观察为白色乳状混悬液，均匀且未见不溶性颗粒物。将样品置于TEM下观察呈椭球型囊泡结构，外形圆整，粒径大小与粒度分析仪测出结果吻合。

图3 Oral-PLF-Lip的外观（a）和TEM观察结果（b）Fig.3 Appearance of Oral-PLF-Lip（a）and TEM observation results（b）

2.4.2 粒径和电位（图4） 采用纳米粒径及Zeta电位分析仪对卡波姆包衣的Oral-PLF-Lip的粒径和Zeta电位进行分析。平均粒径为（257.2±9.3）nm，带有负电性，电位为（-47.1±2.2）mV，分布均匀，有良好的稳定性。

图4 Oral-PLF-Lip的粒径（a）和Zeta电位（b）分布图Fig.4 Distribution diagram of particle size（a）and Zeta potential（b）of Oral-PLF-Lip

图4 （a）的横轴取值范围缩小点；（b）的横轴从-100～100范围内作图。

3 结论

本研究以PLF为模型药物，优化了PLF-Lip的制备工艺，采用TFD-孵育法成功制备了卡波姆包衣的Oral-PLF-Lip，主药用量为10mg，药脂比1∶20，卵磷脂∶胆固醇（PC∶Ch）=10∶1，磷脂浓度（CPC）为15mg·mL-1，包衣材料浓度5g·L-1，透射电镜下该脂质体呈现椭球形囊泡结构，外观均匀圆整。平均Zeta电位为（-47.1±2.2）mV，平均粒径为（257.2±9.3）nm。该处方工艺适用于口服包衣柿叶黄酮纳米脂质体的制备。为PLF能够更好地跨膜吸收从而提高生物利用度、提高疗效奠定了一定基础。