液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法快速筛查海水中大环内酯类抗生素

吴明媛,余 焘,谢宗升,庞燕飞,黄国秋,黄鸾玉,杨姝丽∗

(1.广西壮族自治区水产科学研究院,南宁 530021;2.广西壮族自治区土壤肥料工作站,南宁 530007)

大环内酯类抗生素是由链霉素产生的一类弱碱性抗生素,为一个内酯环通过糖苷键连接一个或多个脱氧糖的结构,可通过抑制细菌蛋白质的合成来发挥抗菌作用。常用的大环内酯类抗生素主要有十四元环的红霉素(ERY)、罗红霉素(ROM)、氟红霉素(FRM)、克拉霉素(CLM)、竹桃霉素(OLM),十五环的阿奇霉素(AZM),十六元环的泰乐霉素(TLS)、替米考星(TMC)、交沙霉素(JSM)等。大环内酯类抗生素除了可以预防和治疗人类细菌感染,也被广泛应用于畜禽、水产养殖中,用于治疗疾病、提高饲料利用率和促进动物生长[1]。

大量使用的抗生素最终以原型或代谢物的形式随排泄物进入环境,在我国大环内酯类抗生素在环境中检出已有较多报道。文献[2]报道了在嘉兴10个典型村镇河道断面均检出大环内酯类抗生素,其质量浓度为3.1～14.68 ng·L－1,显著高于市区河道的最高检出值(6.2 ng·L－1),表明养殖污染可能是导致当地抗生素污染的主要原因;文献[3-4]调查了深圳西丽水库和石岩水库中10种抗生素残留情况,其中脱水红霉素在枯水期和丰水期均有检出,质量浓度为1.8～23.0 ng·L－1;文献[5]在北京地区清河地表水中检出脱水红霉素、CLM、ROM,平均质量浓度分别为47,118,103 ng·L－1。残留在环境中的抗生素除了随着食物链传递威胁人类健康外,还会诱导细菌产生抗生素抗性基因,进而形成耐药性,目前已成为全球公共安全问题。

海水基质中含有大量盐分,其中抗生素残留为ng·L－1级别,需要富集后检测。目前报道的环境中抗生素检测主要使用固相萃取柱富集,然后用液相色谱或液相色谱-质谱联用技术检测[6-11]。HLB固相萃取柱对抗生素有较好的富集效果,但由于柱流量对回收率影响较大,为了获得更好的回收率,通常富集500 mL样品需要用时1 h以上。而固相萃取膜由于比表面积大,对大体积水样富集有明显优势,500 mL样品10 min内即可完成富集,提高了样品处理效率。四极杆静电场轨道阱高分辨质谱具有可获取一、二级碎片离子精确质量数的功能,通过提取一级全扫描谱图中分子离子峰的精确质量数就可获得提取离子流图,从而实现高通量的目标物或非目标物的筛查,确定的目标物在一级全扫描的同时可以获得二级碎片离子质谱图,得到高可靠性的确证结果。

本工作基于C18固相萃取膜技术,建立了液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨率质谱法检测海水中大环内酯类抗生素的方法。该方法缩短了样品前处理时间,所得方法的灵敏度和准确度能满足海水中大环内酯类抗生素的检测要求,可为了解环境中抗生素污染水平提供技术支持。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo Fisher U3000/Q Exactive 型液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱仪;XS205DU 型电子天平;三位固相膜萃取装置;Empore C18固相萃取膜(直径47 mm)。

抗生素混合标准储备溶液:100 mg·L－1,称取ERY、ROM、FRM、CLM、AZM、OLM、TLS、TMC、JSM 标准品各10.0 mg,用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中,于－18 ℃保存。

甲醇、乙腈为色谱纯;甲酸、乙酸铵为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1)色谱条件 Hypersil GOLD C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.9μm,);柱温35 ℃;流量0.2 mL·min－1;进样体积20μL;流动相A 为乙腈,B 为含0.1% (体积分数,下同)甲酸的0.005 mol·L－1乙酸铵溶液。梯度洗脱程序:0～5.0 min时,A 为10%;5.0～6.0 min时,A 由10%升至50%,保持5.0 min;11.1～13.0 min时,A 由50%降至10%。

2)质谱条件 电喷雾离子源,喷雾电压3 200 V;鞘气为氮气,压力275 k Pa;辅助气为氮气,压力69 k Pa;离子传输管温度320 ℃;扫描模式为一级全扫描/数据依赖二级扫描(Full MS/dd-MS2)。一级扫描:扫描范围质荷比(m/z)150～1 000,分辨率70 000,自动增益控制目标(AGC target)3×106,最大注入时间200 ms;二级扫描:分辨率17 500,AGC target 2×105,最大注入时间50 ms,归一化碰撞能量35 e V。其余质谱参数见表1。

表1 9种大环内酯类抗生素的质谱参数Tab.1 MS parameters of 9 macrolide antibiotics

1.3 试验方法

取500 mL 水样,用氨水调节pH 至10,加入5 mL异丙醇,混匀。先将固相萃取膜依次用5 mL甲醇、5 mL 水预处理,再取水样以50 mL·min－1流量过膜,然后用10 mL水淋洗固相萃取膜,减压抽干去除残留水分,再用10 mL甲醇洗脱。洗脱液在40 ℃下氮吹至干,加入1 mL 20%(体积分数,下同)甲醇溶液,旋涡混合溶解残渣,经0.22μm滤膜过滤后,按仪器工作条件进行测定。

2 结果与讨论

2.1 固相萃取条件的选择

样品的酸度会影响抗生素离子化状态,从而影响抗生素与固相萃取材质的结合效率[12]。大环内酯类抗生素为弱碱性化合物,pKa为7～9,在中性条件下会部分生成阳离子,与硅羟基结合较强,难以洗脱。而大环内酯类抗生素在强碱性下不稳定,当pH 大于11时内酯环容易破裂。因此,试验将过膜的海水pH 调节为7,8,9,10,添加标准物质后按照前处理方法富集洗脱,考察酸度对目标物回收率的影响,结果见图1。

图1 酸度对大环内酯类抗生素富集效果的影响Fig.1 Effect of acidity on enrichment effect of macrolide antibiotics

由图1可见:海水pH 为10时,9种大环内酯类抗生素的回收率为79.4%～105%,结果最优。故试验选择海水样品的pH 为10。

2.2 液相色谱条件的选择

液相色谱分离抗生素,常用的流动相主要为甲醇-水、乙腈-水体系。试验比较了甲醇、乙腈两种有机相对目标物的色谱分离及峰形的影响,发现甲醇-水体系中大环内酯类抗生素出峰较晚且峰形宽,在乙腈-水体系下出峰时间较短且峰形好。进一步尝试在水相中添加0.005 mol·L－1乙酸铵和0.1%甲酸以提高离子化效率,所得9种大环内酯类抗生素提取离子色谱图见图2。

由图2可见,9种大环内酯类抗生素峰形尖锐且对称,灵敏度高。

2.3 质谱条件的选择

静电场轨道阱高分辨质谱具有精确质量数的功能,按照欧盟规定,只要有准分子离子和一个碎片离子的精确质量数,完成化合物确证。大环内酯类抗生素含有胺基,容易质子化,[M＋H]＋峰响应很好,因此在正离子模式下采用Full MS/dd-MS2模式分析。对待测样品进行一级全扫描,从一级质谱中提取各化合物精确质量数,得到提取离子色谱图(图2),用于外标法定量。

图2 9种大环内酯类抗生素提取离子色谱图Fig.2 Extracted ion chromatograms of 9 macrolide antibiotics

当设定的目标物一级离子响应达到阈值时,仪器自动触发二级扫描,得到二级离子全扫描谱图,根据二级谱图中特征子离子精确质量数可完成化合物确证。大环内酯类抗生素由内酯环通过糖苷键与1～3个脱氧糖相连构成,主要断裂发生在糖苷键,得到脱氧糖苷碎片离子[13-15]。ERY、ROM、FRM、CLM、OLM、AZM 二级质谱的基峰为m/z158,TLS、JSM、TMC二级质谱的基峰为m/z174,推测为C-5位 的脱氧氨基糖,分子式分别为[C8H16NO2]＋和[C8H16NO3]＋。ERY、ROM、FRM、CLM、AZM 的二级质谱次强峰为脱去C-3位克拉定糖得到的[M＋H－C8H14O3]＋,OLM 的二级质谱次强峰m/z544为脱去C-3 位齐墩果糖的[M＋H－C7H13O3]＋。TLS的m/z772 推测为脱去C7H12O3后,氢重排得到的[M ＋H－C7H12O3]＋。TMC 的m/z696 推测为脱去脱氧氨基糖C8H15O3N所得,JSM 的基峰m/z109推测为[C7H9O]＋。

在同样测试条件下,阳性样品保留时间与标准物质保留时间相对偏差在±5%以内,且检测到母离子与二级碎片离子的精确质量数与理论值的相对偏差绝对值小于5.0×10－4%可以确证该化合物。母离子的精确质量数及其与理论值之间的相对偏差、子离子的精确质量数见表1。

2.4 标准曲线和检出限

用20%甲醇溶液稀释抗生素混合标准储备溶液,配成质量浓度为1～500μg·L－1的混合标准溶液系列,按照仪器工作条件测定。以9种抗生素的峰面积响应值为纵坐标,质量浓度为横坐标进行线性回归。结果表明:9 种抗生素的质量浓度在1～500μg·L－1内与峰面积响应值呈线性关系,相关系数均大于0.996 0,线性回归方程和相关系数见表2。

按照准分子离子的3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),检出限和测定下限结果见表2。

表2 线性参数、检出限和测定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 方法的准确度和精密度

选择未检出大环内酯类抗生素的海水样品作为空白基质样品,分别在20,100,200 ng·L－1的3个浓度水平的抗生素混合标准溶液进行加标回收试验。每个浓度水平做6个平行样品,按试验方法进行测定,结果见表3。

表3 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

结果表明:在3个添加水平下,9种大环内酯类抗生素平均回收率为79.0%～105%,测定值的相对标准偏差(RSD)小于7.5%。

2.6 实际样品分析

取2019年9月采自广西北部湾贝类养殖区域的海水样品,应用所建立方法对25个水样中9种大环内酯类抗生素进行检测,ROM、CLM、AZM、TMC均有不同程度地检出,质量浓度分别在2.71,4.25,1.22,4.17 ng·L－1以内,与其他文献报道相比,处于较低水平。

本工作通过固相萃取膜技术结合液相色谱-静电场轨道阱高分辨质谱法,建立了海水中9种大环内酯类抗生素药物的快速筛查的确证方法,在13 min内完成了对9 种大环内酯类抗生素药物的分析。方法具有前处理简单、分析速度快、灵敏度高的特点,准确度和精密度能够满足海水中大环内酯类抗生素的快速分析需要。