Dicamba对高粱成熟胚愈伤组织诱导及继代的影响

郝曜山，王晓清，王亦学，张欢欢，杜建中，孙 毅

(山西省农业科学院生物技术研究中心，山西 太原 030031)

【研究意义】高粱是全世界仅次于玉米、水稻、小麦和大麦的第5大禾谷类作物，在我国也是重要的杂粮作物之一，是粮食、酿酒及饲料的重要原料来源[1]。目前，由于高粱的种质资源匮乏及有性杂交不亲和等原因[2]，传统的育种方法改良品种进程缓慢，现代基因工程技术为高粱的快速遗传改良提供了新的途径。但植物基因工程技术常常依赖于植物组织培养高频再生体系。尽管对高粱较早就开始了基因转化体系方面的研究，但进展缓慢。高粱被公认为是基因转化最困难的作物之一[3]，主要是由于高粱组织培养愈伤诱导及再生频率较低，高效再生体系建立比较困难。研究并使用新的植物诱导激素是改变这一困境的手段之一。【前人研究进展】麦草畏(Dicamba)是一种植物生长调节剂、除草剂[4]，近些年，利用小麦、玉米等作物的幼胚和成熟胚作为外植体的愈伤组织诱导和分化方面都有较成熟的研究及应用，但在高粱组织培养方面鲜有研究报道。Maria等[5]首次使用Dicamba对小麦成熟胚进行离体培养，证实其在愈伤组织再生方面比2,4-D有更好的效果。彭琳等[6]在小麦成熟胚高频再生基因型筛选及再生体系研究中发现，诱导培养基中麦草畏的诱导效果显著优于2,4-D。Ren等[7]研究结果表明，当麦草畏浓度为4.0 mg· L-1时，周麦18的植株再生频率最高(82.65 %)。李海霞等[8]研究表明，麦草畏诱导的玉米掖478愈伤组织培养一年后仍能保持良好的生长状况，其在提高愈伤组织质量方面具有明显的促进作用。【本研究切入点】以高粱组织培养常用的的诱导激素2,4-D 为对照，研究Dicamba对高粱成熟胚愈伤组织诱导及继代再生的影响及效果，国内外鲜有报道。【拟解决的关键问题】以4个基因型的高粱成熟胚为外植体，研究Dicamba对高粱愈伤组织诱导、继代及愈伤组织再生质量的影响，并与2,4-D诱导高粱成熟胚的效果进行比较研究，建立并优化其组织培养再生体系，为今后高粱遗传转化提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

4个来源不同国家、地区的高粱品种或品系:太粒105(中国)、Is-623(印度)、88BP28(美国)和299(日本)均由山西省农业科学院高粱研究所保存提供。

1.2 培养基

诱导和继代培养基：①MS培养基+ Dicamba (1、2.5、5、7.5、10 mg·L-1) +蔗糖30 g·L-1+KH2PO41.53 g·L-1+Gelrite 2.4 g·L-1+硝酸银5 mg·L-1+ N-Z-Amine 100 mg·L-1。②MS培养基+2,4-D (1、2.5、5、7.5、10 mg·L-1) +蔗糖30 g·L-1+KH2PO41.53 g·L-1+Gelrite 2.4 g·L-1+硝酸银5 mg·L-1+ N-Z-Amine 100 mg·L-1(表1)。③分化培养基：MS+KT 0.5 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1+KH2PO41.53 g·L-1+Gelrite 2.4 g·L-1。

表1 愈伤组织诱导培养基Table 1 The callus induction medium

用KOH将以上培养基pH调为5.8，121 ℃高压灭菌20 min，在灭菌后温度降至60 ℃左右时于超净工作台加入硝酸银和N-Z-Amine。以上试剂均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

培养室的温度为(27±3) ℃，光周期条件为光16 h/暗8 h，光照强度为2000～5000 lx[9]。

1.3 试验方法

1.3.1 高粱成熟胚愈伤组织的诱导 挑选成熟饱满的高粱种子，用自来水冲洗除去表面杂质，无菌条件下75 %的酒精消毒1 min，再用30 %的双氧水消毒1.5～3.0 h。处理后的种子用无菌水冲洗6 遍，用无菌吸水纸吸干种子表面残留的水分，在诱导培养基上黑暗、25 ℃环境条件下诱导愈伤组织。

1.3.2 愈伤组织诱导率及胚性愈伤组织诱导率的统计 高粱成熟种子在诱导培养基上培养 14 d后(诱导培养7 d后高粱种子萌动，部分会长出 1 cm 左右的畸形嫩芽，用镊子将嫩芽生长点部分掐掉，继续诱导培养，愈伤组织大部分由胚轴或胚根诱导产生)，调查统计愈伤组织诱导率(即出愈率)及不同类型愈伤组织比率；将诱导产生的愈伤组织继代培养2次，继续统计不同类型愈伤组织的比例；将存活的不同类型愈伤组织转移到分化培养基上，26 ℃光照条件下培养14～21 d，在光下变绿的愈伤组织计算为胚性愈伤组织，统计胚性愈伤组织诱导率[10]。

在愈伤组织的诱导及继代过程中,参照 AMSTRONG 等[11]、胡彦民等[12]的标准，并结合本研究高粱成熟胚培养的实际试验情况，把高粱产生的愈伤组织划分为 3 种类型。Ⅰ型： 膨大的愈伤部分结构紧密、坚硬，不易分开，表面有尖状或条状突起，生长缓慢，有时会产生丛生芽，不易产生胚状体，不易继代培养；Ⅱ型：介于Ⅰ型和 Ⅲ型之间，愈伤组织呈颗粒状，结构松散、按压易碎，易散， 白色或淡黄色，有光照呈淡绿色，易分化为胚状体，可长期继代培养； Ⅲ型：结构较松软，呈水渍状，有些表面有粘稠的细胞团，常为白色透明或半透明状，继代培养容易，该愈伤组织生长迅速， 但很少能分化为胚状体。

1.3.3 数据处理和分析 出愈率(%)=(高粱种子成熟胚经诱导产生的愈伤组织数/ 接种高粱成熟种子数 )×100 %

E(%)=[Ⅱ型愈伤率/(Ⅰ型愈伤率+Ⅱ型愈伤率+Ⅲ型愈伤率)]×100 %

U(%)=(Ⅱ型愈伤组织分化产生的胚性愈伤组织数/ 该处理获得的总胚性愈伤组织数)×100 %

胚性愈伤率(%)=(产生的胚性愈伤组织数 /转接的总愈伤组织数) ×100 %

统计时已去除因污染、操作失误等原因不能计数的愈伤组织。

2 结果与分析

2.1 Dicamba对高粱成熟胚愈伤组织诱导的影响

将不同基因型的高粱种子(成熟胚)接种在不同的诱导培养基上培养 14 d，进行出愈率的统计调查(表2)。各基因型高粱的愈伤组织诱导率(出愈率)在不同浓度激素处理下存在差异，较低浓度的Dicamba处理下(D1、D2)，材料88BP28和299的平均出愈率较高，培养基中Dicamba浓度(D3、D4、D5)提高时，材料Is-623和88BP28的平均出愈率最高；各个2，4-D浓度(M1、M2、M3、M4、M5)诱导的培养基中，材料Is-623和88BP28的出愈率均高于其他材料；不同浓度Dicamba的诱导培养基上，各基因型材料出愈率在24.7 %～90.7 %变化，而不同浓度的2，4-D处理时，出愈率范围则在72.5 %～90.5 %之间变化，表明各基因型材料使用不同激素处理时，出愈率变化范围不同， Dicamba处理的材料随着浓度变化出愈率变化范围更大；不同基因型材料最佳出愈率的激素种类和质量浓度不同，Is-623在 Dicamb质量浓度为5.0 mg·L-1(D3处理)时出愈率最高，达88.3 %，而Dicamb质量浓度为 7.5 mg·L-1时，太粒105、88BP28和299的出愈率最高，分别达到84.2 %、90.7 %和79.6 %，说明不同基因型对 Dicamb最佳诱导质量浓度的要求有差异，在 2.5 mg·L-12,4-D(M2处理)处理时，所有基因型材料较其它处理浓度出愈率高，不同基因型材料间有较好的一致性；在诱导高粱成熟胚愈伤组织方面，88BP28在Dicamb 7.5 mg·L-1(D4处理)时，出愈率达到90.7 %，2,4-D 2.5 mg·L-1(M2处理)时达到90.5 %，同样Is-623在2种激素诱导的培养基中最高出愈率分别为87.7 %和89.6 %，太粒105在2种激素诱导的培养基中最高出愈率分别为84.2 %和80.0 %，299在2种激素诱导的培养基中最高出愈率分别为79.6 %和82.6 %，说明2种激素在诱导高粱成熟胚出愈率方面无明显差异。

表2 不同植物激素培养基对对高粱成熟胚愈伤组织出愈率的影响Table 2 Effect of different plant hormone medium on callus induction rate of sorghum mature embryo

2.2 不同质量浓度Dicamba与2,4-D对初代培养产生的愈伤组织类型的影响

各基因型高粱材料在Dicamba及2,4-D不同质量浓度及配比下诱导 14 d，将愈伤组织周边的畸形嫩芽、根及种皮去除，切取诱导的愈伤组织并夹碎，放在与原诱导培养基成分相同的继代培养基上培养，7 d后调查各基因型愈伤组织类型的比例(表3)。将高粱种子(成熟胚)初代诱导培养，各基因型材料畸形生长或死亡率(未脱分化率)均比较高，褐变率较低，诱导出愈伤组织的类型中，Ⅰ型和Ⅲ型居多，Ⅱ型相对较少，且多和其它2种类型嵌合生长。E值是所诱导的Ⅱ型愈伤组织率与诱导出的所有愈伤组织率的比值，以往的研究表明，植物组织培养分化再生与Ⅱ型愈伤组织能否产生有很大的关系，因此，E值可以有效预测组织培养再生的效率。不同基因型材料间产生的愈伤组织类型存在差异，太粒105与Is-623Ⅱ型愈伤率在不同激素种类及质量浓度处理条件下均显著高于88BP28与299，其中Is-623初代愈伤培养时在D3培养基中诱导E值达到13.3 %，太粒105初代愈伤培养时在M2培养基中诱导E值达到15.8 %，虽然88BP28出愈率显著高于其它基因型材料，但诱导的愈伤组织类型中Ⅰ型占绝大多数，Ⅱ型几乎没有，各激素种类及质量浓度处理条件下E值均接近0，材料299初代愈伤诱导类型中Ⅲ型愈伤率显著高于其它基因型材料，E值显著低于太粒105与Is-623Ⅱ，但又显著高于材料88BP28。在初代培养诱导愈伤组织类型统计试验中，Dicamba与2,4-D相比并没有显著优势，太粒105的E值最高点出现在2,4-D的M2培养基处理中，而Is-623的E值最高点出现在Dicamba的D3培养基处理中。

表3 成熟胚在不同植物激素脱分化14 d后各基因型诱导愈伤组织的生长情况Table 3 Callus growth of mature embryo induced by different plant hormones 14 days after dedifferentiation

续表3 Continued table 3

2.3 不同质量浓度及配比Dicamba与2,4-D对不同基因型高粱继代培养愈伤组织类型的影响

将诱导产生的各类型愈伤组织放在与原诱导培养基激素种类与质量浓度相同的继代培养基上，继代培养2次(14 d/次)，统计调查不同类型愈伤组织的比例及变化(表4)。结果显示，继代培养与初代诱导培养比较，各基因型材料的褐变率均随着继代次数的增加而增加，88BP28的褐变率在相同浓度梯度下最高；随着继代次数的增加，愈伤组织的类型有所变化，105与Is-623组织培养E值较初代诱导培养显著提高，说明不同类型之间的愈伤组织在继代培养时会相互转变，Is-623随着继代培养次数增加在D3培养基中E值最高，达到20.1 %。 88BP28在2种激素不同质量浓度处理下E值仍接近0，表明Ⅱ型愈伤组织的产生与基因型有关；此外，各基因型材料初代诱导培养的Ⅰ型愈伤率均较高，继代培养后Ⅲ型愈伤率均显著提高，Ⅰ型愈伤率显著降低，说明Ⅰ型愈伤组织不仅可向Ⅱ型愈伤组织转变，也可向Ⅲ型愈伤组织转变；在继代培养中，Dicamba与2,4-D相比，太粒105与Is-623在Dicamba继代试验中E值较初代培养明显增加，而2,4-D在继代试验中E值较初代培养增加缓慢，表明针对一些类型基因型材料如太粒105，Dicamba比2,4-D在继代培养更容易诱导出Ⅱ型愈伤组织。

表4 不同培养基诱导的愈伤组织转入与诱导培养基相同浓度激素的继代培养基培养 2次后各类型的愈伤率统计Table 4 Statistics of callus rate of each type after 2 times of subculture with the same hormone concentration in the media

2.4 不同质量浓度Dicamba与2,4-D对胚性愈伤组织概率的影响

继代诱导所产生的愈伤组织中，胚性愈伤组织的占比与植株再生的概率直接相关，而Ⅱ型愈伤率与胚性愈伤组织的形成的概率直接相关。将存活的不同类型愈伤组织转移到分化培养基上，26 ℃光照条件下培养14～21 d，统计绿色颗粒状，结构松散的愈伤组织数，即胚性愈伤组织数(表5)。U值为本研究中为了 证实胚性愈伤组织的形成与Ⅱ型愈伤组织相关而设定的值，其大小反应形成的胚性愈伤组织数来自Ⅱ型愈伤组织所占的比率。4种基因型材料中， 5.0 mg·L-1Dicamba诱导Is-623的胚性愈伤率最高，胚性愈伤组织中94.4 %由Ⅱ型愈伤组织形成，5.6 %由Ⅰ型愈伤组织形成；太粒105与Is-623胚性愈伤率远高于88BP28与299，说明胚性愈伤组织的形成与基因型相关；相同基因型材料，Dicamba诱导产生的愈伤组织转到分化培养基上时，胚性愈伤的生成率远高于由2,4-D诱导产生的愈伤组织；所有基因型材料及不同的处理的U值均在60 %～100 %，证实了胚性愈伤组织绝大多数来自Ⅱ型愈伤组织。

表5 不同植物激素对胚性愈伤组织概率的影响Table 5 Effects of different plant hormones on embryogenic callus rate

续表5 Continued table 5

3 讨 论

本研究对 4个亲缘关系较远的高粱材料的成熟胚进行了愈伤组织诱导及继代研究，相比较其它基因型材料，无论是Dicamba还是2,4-D诱导，Is-623更易诱导出高质量愈伤组织，太粒105虽能诱导出较高质量的愈伤组织，但诱导率较低，与其它基因型材料相比，88BP28出愈率较高，但高质量愈伤组织(Ⅱ型愈伤组织)很难形成。表明用高粱成熟胚诱导愈伤组织的出愈率及愈伤组织类型受基因型差异影响，该结果与王良群等[13]研究结论相同。

植物激素是植物愈伤组织诱导和胚性分化的关键性因素[8]。对Dicamba与2,4-D的比较显示：不同基因型高粱成熟胚初代愈伤组织诱导试验中，2种激素所诱导的最高出愈率差异不明显，但Dicamba质量浓度 在1～10.0 mg·L-1变化时，其出愈率(Is-623)先从30.0 %(D1)提高到88.3 %(D3)，再下降到80.5 %(D5)，变化幅度50.3 %。其它基因型材料也表现出先升高再降低的变化规律，变化幅度稍有不同。而2,4 -D质量浓度 在1.0～10.0 mg·L-1变化时， Is-623的出愈率先从82.4 %(M1)提高到89.6 %(M3)，再下降到82.1 %(M5)，变化幅度7.5 %，远小于Dicamba诱导时的变化幅度，说明不同基因型材料出愈率受Dicamba的浓度梯度影响更为明显，也说明Dicamba与2,4-D诱导植物形成愈伤组织的机理不同[14]；继代培养及胚性愈伤组织分化试验中，对Is-623和太粒105基因型材料而言，培养基中使用Dicamba作为激素更有利于Ⅱ型愈伤组织及胚性愈伤组织的形成，其诱导分化效果优于2,4-D，该研究结果与李海霞等[8]在Dicamba诱导玉米幼胚的研究结果是相反的，可能由于不同物种之间的基因差异造成。

本试验中，高粱成熟胚组织培养过程中，愈伤组织的褐变率并没有随着Dicamba或2,4-D的质量浓度增加而增加，而随着继代次数的增加而增加，且不同基因型材料间褐变率差异明显，说明高粱组织培养时褐变的发生受自身的基因型因素影响较大。在初代愈伤组织诱导及继代培养的愈伤组织类型统计试验中，发现初代愈伤组织诱导Ⅰ型愈伤组织占比较高，相同质量浓度激素下，随着继代次数增加，愈伤组织类型由Ⅰ型向Ⅱ型、Ⅲ型转变，不同基因型间转变也不尽相同，太粒105与Is-623由Ⅰ型愈伤组织向Ⅱ型、Ⅲ型转变均较多，而88BP28与299则主要向Ⅲ型愈伤组织转变，由此可见，高粱成熟胚遗传体系的建立受基因型影响较大，选择合适的基因型材料(如Is-623)十分关键[15]。另外， Dicamba对高粱成熟胚诱导愈伤组织的影响的研究较少,本研究也仅对其愈伤组织诱导和继代培养进行了统计分析，高粱幼苗再生及生根成活是否有积极作用仍需进一步进行研究。

4 结 论

利用Dicamba对高粱成熟胚进行初代愈伤组织诱导，其出愈率与2,4-D诱导差异不显著，在继代培养及胚性愈伤组织分化试验中，培养基中使用Dicamba作为激素更有利于Ⅱ型愈伤组织及胚性愈伤组织的形成，其效果优于2,4-D；高粱成熟胚诱导愈伤组织及胚性愈伤组织的发生受基因型影响较大，材料Is-623在Dicamba 5 mg·L-1时，与其它材料相比胚性愈伤发生率更高，且褐化及死亡率较低；高粱成熟胚为外植体的组织培养中，随着继代次数增加愈伤组织类型由Ⅰ型向Ⅱ型、Ⅲ型转变的规律；可用E值[Ⅱ型愈伤率/(Ⅰ型愈伤率+Ⅱ型愈伤率+Ⅲ型愈伤率)%]很好地预测组培再生的效率。