发酵床饲养方式对猪情绪因子及抗抑郁因子P11基因mRNA表达的影响

秦 枫，潘孝青，邵 乐，翟 频，杨 杰，张 霞，李 健，顾洪如*

(1.江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏 南京 210014；2.农业部种养结合重点实验室，江苏 南京 210014)

【研究意义】猪舍环境是养猪生产的制约因素之一，影响猪的正常生理行为。在规模化养殖环境下，猪经常表现出咬尾、咬耳、拱腹等异常行为，严重影响猪生理健康，进而造成生产损失。【前人研究进展】随着动物福利重视程度的提高，自由舒适的养殖环境已引起国内外专家的广泛关注[1-3]，动物福利已得到世界上100多个国家和地区的重视和发展[4]。为提高养殖福利，欧美等发达国家通过向传统圈舍投放秸秆、干草、木屑、菌糠等农作物的方式来营造富集环境[3]。发酵床养殖是新兴的生态养猪模式，在母猪生产[5]、育肥猪生长[6-10]有很好的效果，且可提高断奶仔猪平均日增重[11-12]，降低料肉比[6]。发酵床养殖可以为猪提供自由舒适的富集环境，被认为是改善动物福利的有效养殖模式[13-14]。研究表明，发酵床饲养可通过对猪舍内环境和行为特征的影响，提高动物福利[14-15]。发酵床饲养可增加仔猪或育肥猪的站立、运动、探究等行为[6,16]。发酵床养殖能满足猪天性的释放，提高猪生理健康，但对猪机体生理的变化研究较少。【本研究切入点】本试验以60日龄苏钟猪为试验动物，研究发酵床饲养对猪情绪相关物质及抗抑郁因子P11基因mRNA表达的影响，探讨猪机体生理的变化。【拟解决的关键问题】此研究结果为发酵床饲养改善动物福利提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 发酵床垫料制作

本试验2012 年6-9 月， 在江苏省农业科学院六合试验基地进行。发酵床猪舍为经济型钢管大棚结构，顶部覆盖聚乙烯遮阳网。发酵床为地下式发酵床，发酵池地面下挖70 cm，形成地下发酵池。于试验开始前14 d，以风干重为基础，将金针菇菌糠、木屑和稻壳按比例(3∶1∶1)放到发酵池中，均匀喷洒发酵菌剂(按比例稀释)，翻耕调整水分(湿度约为55 %)，堆积发酵，当温度约为70 ℃时即平铺垫料，厚度约为70 cm。

1.2 试验设计与管理

选取日龄(60 ± 3)d、体重为(28.4 ± 0.30)kg的健康苏钟猪60头，随机分为水泥地面饲养组和发酵床饲养组，每组设3个饲喂栏(即3 个重复)，每个重复分别为10头，重复内公母各占一半。育肥前期，水泥地面饲养组和发酵床饲养组饲养密度均为1.0 m2/头。育肥后期，为避免因动物粪尿排泄量的增加造成发酵床床体腐烂情况出现，在育肥前期结束后称进行1 次饲养密度调整，即调整为2.0 m2/头，试验前统一驱虫，试验期为90 d。试验日粮由上海新农饲料股份有限公司提供(313 型、314 型育肥饲料)。发酵床饲养组日常管理主要是进行垫料维护，将猪粪尿比较集中地方散开，每周垫料深耕1次(表层至30 cm)。水泥地面饲养组每天早上8：00 和下午16：00清粪1 次。试验期间，每天09：00 和16：00 人工投料1 次，自由采食和饮水，免疫程序均按常规进行。

1.3 样品采集与指标测定

1.3.1 唾液采集与测定 于试验结束前3 d，每个重复选择3 头进行唾液采集(每组5公4母)。为避免动物自身生理受昼夜节律变化的影响，采集于上午9：00-10：00 进行[17]。具体采集方法：用柄长为30 cm 医用棉签于育肥猪口中充分咀嚼直至棉球完全润湿，每头猪2个棉签，4 ℃离心(4000 r/min,10 min)，-20 ℃冰箱保存，待测。5-HT、β-EP、Ach、Cortisol按试剂盒(南京建成生物工程研究所)规定的方法进行测定。

1.3.2 血清指标采集与测定 在育肥试验第45天(即肥育前期，猪体质量为60 kg 左右)、第90天(即肥育后期，猪体质量为90 kg 左右)采血，每组选取15 头，采用注射器耳缘静脉采血10 mL，离心机4000 r /min 离心10 min，分离血清，-20 ℃保存用于相关指标的测定，5-HT、β-EP、Ach、Cortisol、Mg、Zn按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)规定的方法进行测定。试验期结束，每组选择体重相近猪5头，空腹24 h 后，进行屠宰，采集脑部下丘脑，液氮保存，用于P11蛋白RT-PCR检测。

1.4 RT-PCR检测

Trizol 法提取样品总RNA，样品中RNA 浓度用紫外分光光度计(260 nm)测定。采用10 μl 反应体系，随机引物将RNA 反转录成cDNA。实时荧光定量PCR 采用20 μl反应体系即10 μmol/L Forward primer 0.4 μl，10 μmol/L Reverse primer 0.4 μl，2 × qPCR Master Mix(SYBR Green)10 μl，RNase free H2O 7.2 μl，RT 产物2 μl。

以actin为内参基因，以脑部下丘脑组织cDNA作为模板，进行P11蛋白基因实时荧光定量PCR 检测，用得出的CT 值制作扩增效率曲线。试验采用比较Ct 法(2-△△Ct)进行P11蛋白 基因mRNA 相对表达量的统计分析。试验以actin 作为持家基因，从而校正不同样品初始模板量的差异，每个样品重复3次，从而获得平均Ct值，采用2-△△Ct法计算样品间P11蛋白基因mRNA 的相对表达量。2-△△Ct法采用的公式如下：△△Ct=[Ct(目的基因，试验样品)-Ct(actin，试验样品)]-[Ct(目的基因，参照样品)-Ct(actin，参照样品)]。每个样品的2-△△Ct值即是该样品P11蛋白基因mRNA 的相对表达量。

表1 目的基因引物序列信息

1.5 数据分析

试验数据经Excel 2010 初步处理后，采用SPSS17.0软件中的独立样本T检验进行方差分析。以P<0.05 作为差异显著性判断标准。试验数据以(平均值±标准误)表示。

2 结果与分析

2.1 不同饲养方式对猪唾液中情绪物质的影响

由表2可见，唾液中，发酵床饲养组5-HT、Cortisol浓度显著高于对照组(P<0.05)，β-EP、Ach浓度则无显著差异(P>0.05)。

2.2 不同饲养方式对育肥前期猪血清情绪物质的影响

由表3可见，育肥前期(45 d)，发酵床饲养组猪血清β-EP、Cortisol、Zn浓度显著高于对照组(P<0.05)，5-HT、Ach浓度有提高的趋势(P=0.065，P=0.062)，Mg浓度则无显著差异(P>0.05)。

2.3 不同饲养方式对育肥后期猪血清情绪物质的影响

由表4可见，育肥后期(试验第90 天)，发酵床饲养组猪血清β-EP、cortisol、5-HT浓度显著高于对照组(P< 0.05)，Ach浓度，则显著低于对照组(P< 0.05)，Zn、Mg则无显著差异(P>0.05)。

2.4 不同饲养方式对育肥后期猪下丘脑P11蛋白基因mRNA表达的影响

图1为RT-PCR检测数据统计结果，发酵床饲养组猪下丘脑P11蛋白基因mRNA相对表达量高于水泥地面饲养组，且有提高的趋势(P=0.062)。

3 讨 论

随着畜牧业的发展，集约化饲养模式优点突出，但存在问题也逐步显现，高密度饲养模式虽提高了单位产量，却限制行为，减少人畜互动影响了家畜的健康及福利，直接或间接影响生产性能。单调环境影响家畜的正常生理行为，易造成家畜欲求不满、甚至精神恐惧、挫败感外显沉郁，不利于动物福利及生产性能的发挥。发酵床模式能够提供更好的畜舍环境，利于猪情绪天性的释放，提高福利。5-HT、β-EP、Ach、Zn是机体内与学习认知、情绪密切相关的物质。本试验中，发酵床饲养组猪唾液和血清中5-HT、Cortisol、β-EP的浓度显著提高。已知5-HT参与情绪调节，通过神经传递机能的减退参与情绪障碍包括抑郁与焦虑的形成[18-20]。常用的抗抑郁药主要是调节5-HT浓度，抗抑郁药能提高突触内5-HT水平来缓解抑郁。血浆β-EP可能是诊断抑郁症的一种重要指标[21]。有研究认为抑郁症患者血浆β-EP升高，也有研究表明抑郁症患者血浆β-EP降低。Djurovic等[22]发现，内源性和非内源性抑郁症患者血浆β-EP均低于正常组，且经治疗后均有显著上升。另有研究表明向大鼠脑室中注入β-EP能显著增加5-HT的含量[23]。猪唾液和血清5-HT、β-EP含量的提高可以看出猪机体处于生理愉悦状态。

表2 不同饲养方式对育肥后期猪唾液中情绪物质的影响

表3 不同饲养方式对育肥前期猪血清情绪物质的影响

表4 不同饲养方式对育肥后期猪血清情绪物质的影响

探究行为是猪固有的遗传习性，是其在野生状态下生存的重要手段，主要以嗅、啃、拱等行为加以体现。猪探究行为动机主要来源于两个方面[24]，一方面是寻找食物或寻找舒适地方躺卧即外在探究(欲求探究)，另一方面搜集周围生活环境信息即内在探究(好奇探究)。探究行为是一种积极行为。猪的探究行为是动物福利的重要指标，反映猪认知学习、情绪生理。集约化的养猪环境中，物质贫瘠，严重剥夺猪的探究行为，大多数猪表现“无精打采”，甚至沉郁。发酵床养殖能够增加仔猪和育肥猪的探究行为[6,16]。Lay 等[25]研究也发现发酵床饲养能够增加猪玩耍行为，降低异常行为。Ach和Zn与认知学习行为密切相关。Ach由大脑、海马、皮层等区域释放，促进学习、记忆、注意、自发活动、探究等认知活动[26]，锌离子在大脑中发挥第二信使作用[27]，哺乳动物的大脑皮层、海马和杏仁核中发现了谷氨酸能神经元中有大量富含锌的囊泡，影响学习、记忆、认知及情绪[28]。发酵床提供了较大的自由空间，增强了猪的认识学习活动。育肥前期发酵床饲养组中猪血清Ach、Zn浓度显著提高。由此可见，发酵床养殖可以显著提高猪唾液或血清的情绪物质，释放猪的运动天性，使猪群情绪处于愉悦状态，生理行为福利显著改善。本次试验中，还发现发酵床饲养组唾液或血清Cortisol显著高于传统水泥地面组。皮质醇测定样本来源主要有两种，即血液和唾液。目前，关于富集环境饲养对猪唾液中皮质醇含量的影响存在争议。朱洪龙等[16]研究报道，发酵床饲养组唾液中皮质醇浓度显著高于传统水泥地面组。Klont等[29]研究也表明，富集环境饲养组猪唾液皮质醇浓度显著高于未垫草的传统饲养组，这均与本次结果相一致。但Morrison 等[6]研究发现，与传统水泥地面相比，发酵床饲养对猪唾液皮质醇含量无显著影响。De Jong 等[30]报道，11周龄时富集环境饲养组仔猪唾液皮质醇含量低于未垫草的传统饲养组。发酵床饲养为猪提供自由、舒适的生活环境，一定程度让猪回归自然状态，满足了猪翻拱觅食等习性，这可能对猪下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴内分泌系统产生了影响，从而引起皮质醇的升高。且整个试验期发酵床饲养组猪并未处于应激状态，没有影响生产性能，发酵床有可能提高了猪对环境变化的耐受性。皮质醇的升高可能还会对后期运输有影响，但还需进一步的研究。

P11蛋白(又名S100A10) 参与抑郁症发病，并起抗抑郁作用[31]。P11蛋白在脑、心、胃肠道、肾、肝、肺、脾脏、睾丸、表皮、大动脉以及胸腺等[32]组织广泛表达。在脑部，P11 蛋白表达区域包括大脑皮层、海马、下丘脑、中缝核以及伏隔核等。在抑郁大鼠和H/Rouen小鼠( 抑郁的基因动物模型) 中p11 mRNA和蛋白水平在前扣带回和腹侧纹状体(尤其是伏隔核)下调；在抑郁症自杀患者的海马和杏仁核中p11 mRNA水平下降[29]。Cattaneo等[33]2013年在一项抑郁症药物治疗的基因组研究项目(GENDEP) 中发现，外周血白细胞p11 mRNA 在抑郁患者中表达下降，8周抗抑郁治疗后其表达上调。P11蛋白发挥抗抑郁作用一种途径可能与5-HT相关，p11蛋白会与5-HT受体在抑郁相关多个脑区的细胞表面共定位和相互作用[34-35]，5-HT 可调节p11基因的表达[36-37]。本试验中，发酵床饲养组P11蛋白基因mRNA相对表达高于水泥地面饲养组，P11蛋白的表达与5-HT、β-EP等情绪物质相一致。由此可见，发酵床养殖确实能改善猪群情绪生理，有很好的福利作用，猪群心理健康愉悦，从而能提供更为安全的产品。

4 结 论

在本次试验中，发酵床饲养组能显著提高猪群唾液和血清中5-HT、β-EP、Cortisol，提高育肥前期血清中Ach、Zn的浓度，并能够提高脑部下丘脑P11蛋白基因mRNA表达。发酵床养殖环境可改善猪群的生理情绪，提高认知运动能力，猪群获得更好的愉悦感，生产更健康的产品。