干旱胁迫对黄果柑果实品质及糖酸代谢酶活性的影响

龚成宇，王 毅，2，宋海岩，3，杨 科，陶海青，刘俊宏，龚荣高*

(1.四川农业大学园艺学院，四川 成都 611130；2.广元市利州区工业集中发展区管理委员会，四川 广元 628018；3.四川省农业科学院园艺研究所/农业农村部西南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，四川 成都 610066)

【研究意义】黄果柑(Citruscultivarcv.Huangguogan)隶属芸香科(Rutaceae)柑桔属(Citrus)，为桔橙的天然杂交种，是我国大渡河流域石棉、汉源等干暖河谷地带特有的柑桔宝贵资源[1]。干旱胁迫是近年来植物面临较大的环境胁迫因子之一[2]。干旱胁迫常常会对果树的形态生理、生长发育、果实产量和多种内含物的代谢过程造成极大影响，并且由于干旱胁迫程度和果树种类的不同，所表现出的规律性也不相同[3]。【前人研究进展】干旱胁迫对果实外在品质的影响主要体现在果实变小、硬度增大等方面[4]。在枇杷[5]、鸭梨[6]、草莓[7]和葡萄[8]的研究中均表明果实的可溶性固形物、可溶性糖含量及糖酸比值在水分胁迫下有一定的提升，张萍等[9]在枸杞的研究中也发现适当的干旱胁迫处理有利于果实中己糖的积累，果实产量降低但果实品质变优，姜妮等[10]与石学根等[11]对柑橘的研究表明一定的水分胁迫有利于糖分含量增加，但对果实有机酸含量的影响并不明显，而邓胜兴[12]的研究却表明土壤相对含水量与果实有机酸含量呈极显著负相关。蒲雪荔[13]研究表明，果实发育初期受到AI、SS分解作用较大，而NI(蔗糖中性或碱性转化酶)、SS合成发挥作用的阶段主要是果实发育中后期，SPS是整个果实发育过程中可溶性糖积累的关键酶；CS(柠檬酸合成酶)、PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)、ACO、NAD-IDH和MDH(苹果酸脱氢酶)均是影响柑橘果实有机酸代谢的重要酶。【本研究切入点】目前黄果柑的主要产地气候干热少雨，年降水量分布不均，春季干旱现象严重，黄果柑产业已深受当地气候影响。【拟解决的关键问题】本试验通过研究不同程度干旱胁迫下黄果柑的果实品质变化以及糖酸代谢变化，为全面揭示干旱胁迫对黄果柑果实生长发育及糖酸代谢机制的影响提供参考，更为结合生产地气候因素找到黄果柑增糖降酸以及提质增效的产业技术研发提供理论基础和实践指导。

1 材料与方法

1.1 试验地点与材料

试验地点位于雅安市汉源县小堡藏族彝族乡解放村(N 29°18′,E 102°33′，海拔950 m)，地处大渡河中游干暖河谷区域，亚热带气候区，少雨且不均，年均降水量在650 mm左右，土壤类型为红壤土。供试材料为7年生晚熟黄果柑，砧木为枳壳，植株健壮、树势一致，常规栽培管理措施。

1.2 试验方法

所有材料从2018年4月开始统一管理，对试验田进行地膜覆盖和挖沟排水来避免降雨对试验处理的干扰，处理开始后每3 d用德国STEPES MST3000+型便携式水分测定仪进行一次土壤相对含水量的测定，通过多排少补的方式使各处理的土壤相对含水量于花后30 d左右开始长期处于试验设置的范围内，各处理如表1所示，以单个小区为一个处理，每个小区3株黄果柑树体，每个处理重复3次。分别于达到干旱胁迫程度后的30 d(即花后60 d)开始对每个处理的果实进行收集，果实的收集按照每棵树的东、南、西、北4个方位采摘大小一致、无病虫害且无机械损伤的黄果柑果实，此后每30 d采集一次样品直至果实成熟，样品采集次数共计10次。每次采集的样品立即放入冰盒带回实验室，用于糖酸组分含量及糖酸代谢酶活性指标测定的样品果实切成对称的4份，取每份的中间部分果肉用液氮品保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 黄果柑果实的品质 指标通过天平和游标卡尺测定果实相关外观品质指标，FR-5105型硬度计测定果实硬度。可溶性固形物含量利用手持式折光仪(手持式糖度计)测定，Vc含量采用2，6-二氯酚靛酚滴定法测定[14]。可溶性总糖含量的测定用斐林试剂法，有机酸总含量的测定采用NaOH中和滴定法。

1.3.2 黄果柑果实中糖酸组分含量 参照肖玉明[15]的高效液相色谱(HPLC)法进行黄果柑果实糖酸的提取与测定。

1.3.3 黄果柑果实中相关糖酸代谢酶活性 黄果柑果实中相关糖酸代谢酶酶液的制备和酶活性的测定均参照龚荣高[16]的方法。

1.4 试验数据统计与分析

所有指标重复测定3次后取平均值。通过Microsoft Excel 2010、SPSS20.0和Origin85等平台对数据进行整理、检验并绘图。

表1 各胁迫处理的土壤相对含水量范围

表2 干旱胁迫对黄果柑成熟果实单果重、可食率及纵横径的影响

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对黄果柑成熟果实果实品质的影响

由表2可知，黄果柑成熟果实的单果重与干旱胁迫程度表现出极显著负相关，果实纵、横径均与干旱胁迫程度表现出显著负相关，但各处理间的果形指数和可食率却以LD处理下最大，且各处理间未达到显著差异水平。说明干旱胁迫显著影响了黄果柑的果实大小，但对果形变化和可食率的影响并不显著。由表3可知，黄果柑成熟果实的Vc含量和有机酸含量均随着胁迫程度的加重而降低，而可溶性固形物含量、可溶性总糖含量及糖酸比均以LD处理下的果实最大。其中，果实的Vc含量、有机酸含量及糖酸比均在各处理间达到显著差异水平，果实可溶性总糖含量差异达到极显著水平，说明干旱胁迫对黄果柑果实内含物的含量具有显著影响，尤其表现在对果实可溶性糖含量的影响。

2.2 干旱胁迫对黄果柑果实发育过程中糖含量的影响

由图1可知，果实发育后期蔗糖含量明显高于葡萄糖和蔗糖含量，说明黄果柑的糖积累以蔗糖为主。从干旱胁迫后的90 d开始，各处理间可溶性总糖含量表现为LD>CK>SD，直到果实完熟，LD处理的果实可溶性总糖含量较CK处理高11.45 %，而SD较CK处理则降低了6.61 %。各胁迫处理间的糖组分含量差异主要发生在果实成熟后期，蔗糖含量差异表现为LD>SD>CK，葡萄糖和果糖含量均表现出与可溶性总糖含量相一致的差异，即LD>CK>SD，说明LD处理能较大程度地提升果实中可溶性总糖及各糖组分含量，而SD处理虽然对果实中蔗糖含量有一定的提升，但降低了果实中果糖和葡萄糖的含量，从而抑制了果实可溶性总糖的积累。

2.3 干旱胁迫对黄果柑果实糖代谢相关酶活性的影响

2.3.1 干旱胁迫对黄果柑果实蔗糖合成酶类活性的影响 由图2可知，果实发育前期SS合成方向及SPS的活性在各胁迫处理间并没有表现出显著差异。自胁迫处理后的180 d开始，SS合成方向的活性在各胁迫处理间表现为与可溶性总糖一致的规律，即LD>CK>SD。SPS活性自胁迫处理后的180 d开始在各胁迫处理间表现出相对明显的差异规律，这一差异规律与总糖积累的不同，但与各处理间蔗糖的积累差异规律一致，即LD>SD>CK，且除胁迫处理后的240 d以外，其余各时期各处理间均达到显著差异水平，由此说明，SS合成方向是各胁迫处理间果实可溶性总糖积累后期出现差异的关键因素，而SPS则是引起各胁迫处理间果实蔗糖积累后期出现差异的关键酶。

2.3.2 干旱胁迫对黄果柑果实蔗糖分解酶类活性的影响 由图3可知，黄果柑果实发育过程中， AI和SS分解方向的活性都呈现出整体降低的趋势，而后期NI活性远远高于AI，由此说明，在果实发育前期，果实形态构建高峰需要消耗大量糖分解所提供的能量。前期，果实蔗糖分解酶类中对果实糖积累的影响主要由SS分解方向和AI活性所决定，而进入果实膨大期以后，NI是影响糖积累的关键酶。从各胁迫处理间酶活性的差异来看，在整个发育过程中各胁迫处理间NI活性均未表现出显著差异，而SS分解方向的活性在胁迫处理前期表现出一定的差异，但未达到显著水平。由此，前期果实糖积累的过程可能与SS分解方向的活性有关。自胁迫处理后150 d开始，AI表现为CK>SD>LD，由此说明，在黄果柑果实蔗糖分解酶中，NI和SS分解方向的活性虽然高于AI，但是胁迫处理间的糖积累差异主要由AI造成。

表3 干旱胁迫对黄果柑成熟果实部分内含物指标的影响

2.4 干旱胁迫对黄果柑果实发育过程中酸含量的影响

由图4可知，黄果柑生长发育过程中柠檬酸在有机酸中占比达50 %～95 %，苹果酸和奎宁酸后期占比极低，说明黄果柑酸代谢以柠檬酸为主。各胁迫处理下的果实柠檬酸和有机酸含量均在胁迫处理后90 d达到积累峰值，随后便表现出不同程度的降解，而苹果酸和奎宁酸均表现出了“L”型的降解趋势，其降解程度表现为SD>LD>CK，果实成熟后期，各胁迫处理间果实有机酸和酸组分含量均表现为CK>LD>SD，其含量差异与降解程度相反，其中，果实成熟时SD与LD处理的果实有机酸含量分别较CK处理显著降低，降幅达27.24 %和17.59 %，由此可以推断果实最终有机酸含量的差异并非完全由果实有机酸的积累量所决定，而是由酸的降解程度所决定，且干旱胁迫处理有利于黄果柑果实中酸的降解。

2.5 干旱胁迫对黄果柑果实有机酸代谢相关酶活性的影响

2.5.1 干旱胁迫对黄果柑果实有机酸合成酶类活性的影响 由图5可知，胁迫前期果实中CS、PEPC与MDH活性均快速升高，与有机酸含量的迅速积累保持一致，而胁迫后期除CS的活性还保持一个相对较高的状态外，PEPC与MDH的活性则伴随着黄果柑果实中有机酸含量的稳定均降低到发育全程的最低水平，且这3种酶的酶活性在不同程度胁迫处理的果实间均没有表现出较强的差异规律性。由此说明，黄果柑果实中CS、PEPC和MDH的活性对果实发育前期有机酸的积累具有重要影响，但不同程度干旱胁迫间果实有机酸含量的差异并不是由CS、PEPC和MDH酶活性所决定的。

2.5.2 干旱胁迫对黄果柑果实有机酸分解酶类活性的影响 由图6可知，细胞质ACO和NAD-IDH均在果实发育的中后期保持着相对较高水平的活性，说明细胞质ACO和NAD-IDH是黄果柑果实发育酸降解过程中的重要酶。在各胁迫处理间，果实中线粒体ACO全程没有表现出明显的活性差异，细胞质ACO和NAD-IDH自胁迫处理后150 d开始，各处理间活性差异表现为SD>LD>CK，与各处理间果实成熟后期有机酸降解阶段的降解程度差异一致。说明，有机酸降解阶段细胞质ACO和NAD-IDH是造成不同干旱胁迫处理间果实有机酸含量差异的主要酶。

3 讨 论

现有研究认为适度的干旱胁迫会导致果实变小，硬度增大，在少量降低果实有机酸含量和Vc含量的前提下能够有利于可溶性固形物、可溶性糖的积累[17-18]。本试验结果表明干旱胁迫会抑制果实大小的发育，而对果形不会造成太大的影响，轻度干旱胁迫在适度降低果实外观品质的前提下能有效提升黄果柑的内在品质，而重度胁迫显然会降低果实的整体品质，这与前人的研究结论基本一致。糖代谢方面，轻度干旱胁迫显著提升了黄果柑果实中可溶性总糖及糖组分含量，而重度干旱胁迫虽然提升了果实中蔗糖的含量，却抑制了葡萄糖、果糖及可溶性总糖含量，猜想这可能是由于在重度干旱胁迫环境下，成熟期果实内部更容易发生葡萄糖和果糖向蔗糖的转化。进一步研究表明SS合成方向的活性自胁迫处理后180 d开始与各胁迫处理间可溶性总糖含量表现为一致的差异规律，AI在各处理间表现出了与果实蔗糖含量相反的差异趋势，结合SPS的活性差异验证了重度胁迫能加快果实果糖和葡萄糖向蔗糖的转化从而提升果实蔗糖含量的猜想，但其酶活性的差异对不同程度干旱胁迫间葡萄糖、果糖以及可溶性总糖含量的差异影响并不明显，这可能是由于其酶活性差异虽然显著，但整体活性较低所造成的。说明SS合成方向是各胁迫处理间在果发育后期可溶性总糖含量出现差异的关键酶，而SPS和AI则是引起各胁迫处理间果实蔗糖积累出现差异的关键酶，这与曹淑燕等[19]在研究相同管理水平下株间黄果梢果实糖含量差异所找到的影响关键酶所一致。柑橘酸代谢方面，Yamaki[20]研究发现10余种柑橘有机酸组分，但大部分柑橘以柠檬酸代谢为主，本研究表明黄果柑果实有机酸的积累也是以柠檬酸为主。干旱胁迫能加强黄果柑果实发育后期柠檬酸、苹果酸和有机酸的降解程度，且干旱胁迫程度越大，果实中酸含量的降低越显著，这与张规富[21]干旱胁迫对宽皮柑橘的影响结果一致，但邓胜兴[12]与肖明玉[15]在温州蜜柑上的研究结果却认为，随着干旱胁迫程度的增大，果实有机酸含量会发生显著升高，这可能是由于柑橘品种间或不同栽培地柑橘树体对干旱胁迫的适应性不同所造成。进一步研究表明，整个果实发育期，PEPC、MDH与线粒体ACO在不同程度干旱胁迫处理间均没有表现出显著差异，而果实发育后期，各处理间的细胞质ACO与NAD-IDH活性差异表现出与各处理间有机酸降解程度所一致的规律。说明细胞质ACO与NAD-IDH是造成不同程度干旱胁迫对黄果柑果实有机酸含量差异的主要酶，且干旱胁迫程度越高，2种酶的酶活性越高，从而有利于黄果柑果实有机酸的降解。曹淑燕等[19]在不同砧木对黄果柑果实有机酸代谢相关酶活性的影响研究也认为，砧木间果实有机酸差异是ACO和NAD-IDH活性共同作用的结果，这与本研究的结果具有一致性。

4 结 论

轻度干旱胁迫在适度降低果实大小的前提下较大程度地提升果实中可溶性总糖及各糖组分含量，降低酸含量，有效提升了黄果柑的内在品质，而重度干旱胁迫虽然提升了果实蔗糖的含量，但限制了果实葡萄糖、果糖及可溶性总糖的积累，降低了黄果柑的整体品质。糖代谢方面，SS合成方向是各胁迫处理间果实可溶性总糖含量出现差异的关键酶，而SPS和AI则是引起各胁迫处理间果实蔗糖含量出现差异的关键酶。酸代谢方面，黄果柑果实中细胞质ACO与NAD-IDH是造成干旱胁迫下有机酸含量差异的关键酶，干旱胁迫能有效提升这2种酶的酶活性从而加剧黄果柑果实中有机酸的降解。