布托啡诺联合罗哌卡因镇痛对大鼠创面愈合、瘢痕的影响及机制研究

管钊铭 刘岩 李琳 赵浦舒 刘俊江

[摘要] 目的 研究布托啡諾和罗哌卡因对SD大鼠血液中IL-1、IL-6、IL-10，创面周围GM-CSF的表达、创面愈合及瘢痕组织的影响。 方法 取SPF级雄性SD大鼠64只，随机分为4组，B组大鼠鼠尾静脉注射布托啡诺0.3 mg/（kg·12 h），R组大鼠创面周围浸润注射0.5%的罗哌卡因1 mL/（kg·12 h），B+R组大鼠鼠尾静脉注射布托啡诺0.3 mg/（kg·12 h）和创面周围浸润注射 0.5%的罗哌卡因1 mL/（kg·12 h），C组大鼠鼠尾静脉注射等容量0.9%氯化钠注射液。在造模后的第3、7、10天，每组随机取4只大鼠用ELISA法测定血清IL-1、IL-6、IL-10和创面GM-CSF的含量，每组剩余4只SD大鼠用来观察创面愈合时间和愈合后瘢痕面积。通过HE染色和MASSON染色病理切片观察创面病理变化。 结果 在第3天、第7天和第10天，B+R组IL-1、IL-6的含量低于C组（P<0.05）;在第3天和第10天，B组和B+R组IL-10的含量高于C组（P<0.05）;在第3天和第7天，B+R组的GM-CSF/BCA的比值高于C组和R组（P<0.05）;B组、R组和B+R组愈合时间均短于C组（P<0.05），而B+R组在创面愈合率和瘢痕面积方面优于C组和R组（P<0.05）;B+R组的HE染色和MASSON染色组织学表现优于C组、B组和R组（P<0.05）。 结论 布托啡诺联合罗哌卡因可以通过抑制IL-1和IL-6的表达、增强IL-10和GM-CSF的表达，使创面更快更好地愈合，减少创面愈合后的瘢痕面积。

[关键词] 布托啡诺;罗哌卡因;创面愈合;瘢痕

[中图分类号] R246.233          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）10-0036-05

Research on the impacts and mechanism of analgesia of butorphanol combined with ropivacaine on wound healing and scar in rats

GUAN Zhaoming1， 2   LIU Yan2   LI Lin2   ZHAO Pushu2   LIU Junjiang1

1.The First Clinical Medical College，Mudanjiang Medical University， Mudanjiang   157011， China; 2.Department of Anesthesiology， Hongqi Hospital Affiliated to Mudanjiang Medical University， Mudanjiang   157011， China

[Abstract] Objective To research the impacts of butorphanol and ropivacaine on the expression of IL-1， IL-6 and IL-10 in blood， GM-CSF expression around wound， as well as wound healing and scar tissue in SD rats. Methods A total of 64 SPF male SD rats were selected and randomly divided into group B， group R， group B+R and group C. Rats in group B were injected with butorphanol of 0.3 mg/（kg·12 h）via tail vein，rats in group R were injected with 0.5% ropivacaine of 1 ml/（kg·12 h）around the wound，rats in group B+R were injected with butorphanol of 0.3 mg/（kg·12 h）via tail vein and 0.5% ropivacaine of 1 mL/（kg·12 h） by infiltration around wound respectively，while rats in group C were injected with 0.9% sodium chloride injection in equal volume via tail vein. On the 3rd， 7th and 10th day after modeling， 4 rats in each group were randomly selected to measure the contents of serum IL-1， IL-6， IL-10 and wound GM-CSF by ELISA method，and the remaining 4 SD rats in each group were used to observe the wound healing time and scar area after healing. Pathological changes of wounds were observed by HE staining and MASSON staining pathological section. Results On the 3rd， 7th and 10th day， the contents of IL-1 and IL-6 in group B+R were lower than those in group C（P<0.05）. On the 3rd and 10th day， the content of IL-10 in group B and group B+R was higher than that in group C（P<0.05）. On the 3rd and 7th day， the ratio of GM-CSF/BCA in group B+R was higher than that in group C and group R （P<0.05）. The healing time in group B， group R and group B+R was shorter than that in group C（P<0.05）. The wound healing rate and scar area in group B+R were superior to those in group C and group R（P<0.05）. Histological manifestations of HE staining and MASSON staining in group B+R were superior to those in group C， group B and group R（P<0.05）. Conclusion Butorphanol combined with ropivacaine can inhibit the expression of IL-1 and IL-6， and enhance the expressions of IL-10 and GM-CSF， so as to make the wound healing faster and better， and reduce the scar area after wound healing.

[Key words] Butorphanol; Ropivacaine; Wound healing; Scar

随着现代疼痛学的不断发展，镇痛药物与镇痛技术也随之不断更新。目前，术后镇痛已广泛应用于临床术后，有效的术后镇痛既可以降低患者的痛苦，也可以加快术后创面愈合速度，但创面愈合后必然会形成瘢痕组织[1]。在瘢痕组织形成的过程中，如果胶原纤维发生异常就会形成病理性瘢痕，对患者的生活质量会造成一定的影响[2]。在临床常用的镇痛药物中，布托啡诺和罗哌卡因可用于患者术后镇痛，并有研究证实术后应用布托啡诺或罗哌卡因有利于患者的术后恢复[3-4]。本研究的主要目的是研究布托啡诺和罗哌卡因对SD大鼠（Sprague-dawley，SD）血液中白介素（IL-1、IL-6、IL-10）和创面周围粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的表达及对创面愈合情况和瘢痕组织的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

选取SPF级的雄性SD大鼠64只[辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2020-0001]，体重（380±20）g。大鼠IL-1、IL-6、IL-10和GM-CSF ELISA检测试剂盒，BCA蛋白定量试剂盒（合肥莱尔生物科技有限公司）。MASSON染液（南京建成生物工作研究所）。酒石酸布托啡诺注射液（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20143106，规格：2 mL：4 mg）、盐酸罗哌卡因注射液（Astra Zeneca AB，进口药品注册证号H20140763，规格：100 mg：10 mL）。所有实验经动物保护和倫理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 分组  将符合标准的雄性SD大鼠进行随机分组，每组各16只，共分为4组，分别为布托啡诺组（B组）、罗哌卡因组（R组）、布托啡诺+罗哌卡因组（B+R组）、空白对照组（C组）。

1.2.2 模型制备  SD大鼠称重后，用0.6%戊巴比妥钠以0.1 mL/10 g进行腹腔麻醉，麻醉后固定其颈背部皮肤，用外科剪剪去其颈背部约3 cm×3 cm面积的体毛，碘伏消毒后以脊柱为中线做一约1 cm×1 cm大小的皮肤全层缺损。

1.2.3 给药方法  B组SD大鼠鼠尾静脉注射布托啡诺（江苏恒瑞医药股份有限公司，国药准字H20143106，规格： 2 mL：4 mg）0.3 mg/（kg·12 h），R组SD大鼠创面周围浸润注射0.5%的罗哌卡因（Astra Zeneca AB，进口药品注册证号：H20140763，规格：100 mg：10 mL）1 mL/（kg·12 h），B+R组SD大鼠鼠尾静脉注射布托啡诺（同B组）0.3 mg/（kg·12 h）和创面周围浸润注射0.5%的罗哌卡因（同R组）1 mL/（kg·12 h），C组SD大鼠鼠尾静脉注射等容量0.9%氯化钠注射液，每日定时给药。

1.2.4 标本处理  在第3、7、10天，每组随机取4只SD大鼠，记录其创面面积，然后抽取外周静脉血，离心后取上层血清液，放置于-20℃的冰箱中保存，用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测SD大鼠血清中IL-1、IL-6和IL-10的含量。然后将大鼠处死，剪取创缘外周5 mm×5 mm包括创面的皮肤组织，均分成两份后，一份放置于-80℃的冰箱中保存，通过ELISA法测定GM-CSF的表达，为了避免取材的误差，通过BCA蛋白定量法检测各组织的蛋白浓度，以GM-CSF的含量与BCA蛋白含量的比值比较各组标本中GM-CSF含量;另一份置于4%的甲醛溶液中固定，用于制作苏木精-伊红染色（Hematoxylin-eosin staining，HE染色）和MASSON染色病理切片。最终每组余4只SD大鼠用于观察创面愈合时间和愈合后瘢痕面积。

1.3 观察指标及评价标准

1.3.1 IL-1、IL-6和IL-10的表达  通过ELISA法，检测各组SD大鼠在第3天、第7天和第10天血清中IL-1、IL-6和IL-10含量。

1.3.2 GM-CSF的表达  通过ELISA法，检测各组SD大鼠在第3天、第7天和第10天组织中GM-CSF含量，同时使用BCA蛋白定量法检测各组织的蛋白浓度，应用GM-CSF含量/蛋白含量的比值观察GM-CSF的表达[5]。

1.3.3 创面愈合率  通过坐标纸读取法，分别记录各组SD大鼠原始创面面积、第3天、第7天和第10天的未愈合创面面积。公式：某时刻的创面愈合率=（原始造模面积-该时刻未愈合面积）/原始造模面积×100%，由此可计算出各组SD大鼠各时刻的创面愈合率[5]。

1.3.4 创面愈合时间和愈合后瘢痕面积  观察各组SD大鼠创面上皮化，通过上皮化确定创面愈合时间并记录[6]，并通过坐标纸读取法，分别记录各组SD大鼠创面愈合后瘢痕的面积。

1.3.5 HE染色和MASSON染色  取各组SD大鼠的皮肤，将其放置于4%的甲醛溶液中固定48 h，取出后进行脱水、石蜡包埋、切片，进行HE染色和MASSON染色。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，采用单因素方差分析法（ANOVA），组间相互比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组SD大鼠血清中IL-1含量比较

在创面形成后的第3天，R组和B+R组IL-1的含量低于C组和B组，差异有统计学意义（P<0.05）;在第7天和第10天，B组、R组和B+R组IL-1的含量低于C组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 各组SD大鼠血清中IL-6含量比较

在创面形成后的第3天，R组和B+R组IL-6含量低于C组和B组，差异有统计学意义（P<0.05）;在第7天和第10天，B组、R组和B+R组IL-6含量低于C组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3 各组SD大鼠血清中IL-10含量比较

在创面形成后的第3天，B组和B+R组IL-10含量高于C组和R组，差异有统计学意义（P<0.05）;在第10天，B组、R组和B+R组IL-10含量高于C组，差异有统计学意义（P<0.05）。。

2.4 各组SD大鼠组织中GM-CSF/BCA比值比较

在创面形成后的第3天，B+R组的GM-CSF/BCA比值高于C组、B组和R组，差异有统计学意义（P<0.05）;在第7天，B组和B+R组的GM-CSF/BCA比值高于C组和R组，差异有统计学意义（P<0.05）;在第10天，C组GM-CSF/BCA比值高于R组和B+R组，差异有统计学意义（P<0.05）。。

2.5 各组SD大鼠创面愈合率比较

在创面形成后的第3天，B组和B+R组创面愈合率高于C组和R组，差异有统计学意义（P<0.05）;在第7、10天，B+R组创面愈合率高于C组、B组和R组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.6 各组SD大鼠创面愈合时间和瘢痕面积比较

各组余4只SD大鼠创面愈合后，B组、R组和B+R组的创面愈合时间短于C组，差异有统计学意义（P<0.05）;B组、R组和B+R组的瘢痕面积明显小于C组，其中B组和B+R组的瘢痕面积明显小于R组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.7 HE染色分析

在创面形成后的第3天，与C组相比，B组、R组和B+R組炎症细胞数量明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）;在第7天，各组可见新生的毛细血管，且B+R组毛细血管的数量高于C组、B组、R组，差异有统计学意义（P<0.05）;在第10天，各组的成纤维细胞和炎症细胞数量未见明显差异;在创面愈合时，各组的成纤维细胞、毛细血管和炎症细胞数量未见明显差异。见封三图2。

2.8 MASSON染色分析

在创面形成后的第3天直至创面愈合，各组胶原纤维的含量逐渐增加;在第3天，各组胶原较为稀疏和分散，R组和B+R组胶原纤维含量略高于C组和B组;在第7天，R组胶原纤维的含量略低于其他组;在第10天，B组胶原纤维的含量略低于其他组;在创面愈合后，R组和B+R组与C组和B组相比较，胶原纤维的排列更加有序，瘢痕组织学表现较好。见封三图3。

3 讨论

目前，术后康复已成为国内外医学界密切关注的焦点，其中麻醉在患者术后康复方面起着重要作用，有效的术后镇痛不但可以减轻患者的痛苦，还可减少体内炎症因子的释放，加快术后创面愈合，缩短住院时间，提高患者术后康复质量。创面愈合是一个复杂过程，包括止血、炎症、增殖和重塑等阶段[7]。最新研究表明，炎症反应与创面愈合密切相关，在炎症阶段，炎症细胞可以分泌细胞因子和生长因子使创面愈合。GM-CSF作为一种生长因子，当机体受到损伤性刺激时，GM-CSF的表达将会增加，参与到创面愈合的过程中[8-10]。而在重塑阶段，成纤维细胞会向肌成纤维细胞发生转变，在细胞因子的调节下，胶原与细胞外基质的不断翻转，最终形成瘢痕组织[11]。瘢痕组织的形成是创面愈合的生理病理过程，大量实验证实瘢痕形成与白介素有关，其中IL-1可通过促炎症反应等机制促使瘢痕形成和纤维化[12]。而与IL-1不同，IL-10是一种抗炎症和抗纤维化的重要因子[13]。Kieran等[14]发现，小鼠应用重组人 IL-10处理后，炎症反应减弱，瘢痕组织学表现较好，目前重组人IL-10应用于瘢痕修复已处于临床Ⅱ期[15]。IL-6作为一种重要的促炎症细胞因子，在组织损伤中起着重要作用[16]，在瘢痕成纤维细胞中，IL-6的基因表达及分泌量均明显高于正常细胞，表明IL-6在瘢痕形成中可能起着重要作用。

布托啡诺是临床上常用的阿片类药物，其主要激动κ受体，对μ受体也有部分激动作用。有研究表明，κ阿片受体激动剂和μ阿片受体拮抗剂可增加IL-10的含量[17-18]。IL-6是创伤应激反应的指标之一，布托啡诺可抑制IL-6的释放，并可以平衡术后患者血清中IL-1、IL-6和IL-10水平的变化[19]。在局部麻醉药物中罗哌卡因是常用的长效酰胺类药物，创面周围局部浸润罗哌卡因可促进创面愈合，增加瘢痕组织面积，这可能与GM-CSF浓度升高、炎症反应有关，且罗哌卡因具有一定的抗炎作用。有实验证实，罗哌卡因可以降低腹膜炎大鼠IL-6的含量[20-21]。

本实验结果显示，在第3天，R组和B+R组IL-1、IL-6的含量低于C组和B组（P<0.05）;在第7天和第10天，B组、R组和B+R组IL-1、IL-6的含量低于C组（P<0.05），提示单独使用或联合应用布托啡诺和罗哌卡因可以抑制IL-1和IL-6表达，与之前报道的文献结果一致[19];在第3天，B组和B+R组IL-10的含量高于C组和R组（P<0.05），在第10天，B组、R组和B+R组IL-10含量高于C组（P<0.05），提示单独使用或联合应用布托啡诺和罗哌卡因可以增加IL-10表达;在第3天，B+R组的GM-CSF/BCA比值高于C组、B组和R组（P<0.05），在第7天，B组和B+R组的GM-CSF/BCA比值高于C组和R组（P<0.05）;在第10天，C组GM-CSF/BCA比值高于R组和B+R组（P<0.05），提示单独使用或联合使用布托啡诺和罗哌卡因在第3天GM-CSF/BCA比值达到高峰后逐渐开始下降，C组GM-CSF值下降较为缓慢，可能与C组创面愈合时间有关。从愈合时间来看，B组、R组和B+R组均短于C组（P<0.05），而B+R组在创面愈合率和瘢痕面积方面优于C组和R组（P<0.05），提示布托啡诺联合罗哌卡因的效果要优于单独使用，布托啡诺联合罗哌卡因不但可以更好地提高创面愈合率，而且还可以减少创面愈合后的瘢痕面积，缩短创面愈合时间。从HE染色和MASSON染色来看，布托啡诺联合罗哌卡因组的组织学表现较好。

综上所述，布托啡诺联合罗哌卡因可以通过抑制IL-1和IL-6的表达、增强IL-10和GM-CSF的表达，使创面更快更好地愈合，减少了创面愈合后的瘢痕面积。但是布托啡诺和罗哌卡因联合使用是否会相互影响、两种药物合用的最适浓度等问题目前仍不完全清楚，还需要不断深入研究。

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（收稿日期：2020-09-04）