黑麦草对几种Cd污染钝化剂的生物学响应研究

燕傲蕾，孙玉喜，田 宇，张 婷，陆景磊

(亳州学院 生物与食品工程系，安徽 亳州 236800)

土壤是人类赖以生存的物质基础，目前我国现有耕地近20%已遭受重金属污染[1]，生态环境部发布的《2019中国生态环境状况公报》明确指出“影响农用地土壤环境质量的主要污染物是重金属污染，其中镉为首要污染物”。镉(Cd)生物毒性高、转移性强，容易通过食物链进入人体，近年来，贵州赫章、湖南衡东、江西赣州多地均发生农作物重金属镉超标事件，土壤Cd污染问题已对农产品质量安全和人类健康构成了严重威胁。目前治理土壤重金属污染的思路之一是原位钝化技术，即通过向土壤中添加一些可吸附重金属的材料，降低重金属元素在土壤环境中的迁移性及其生物可利用性，最终减少植物对重金属的吸收和累积[2]。重金属钝化修复操作简单、不影响作物生产、适合大面积推广，是土壤重金属污染修复最有效的方法之一[3]。

目前，曾卉、计海洋等研究者在土壤钝化材料的筛选、钝化剂对重金属的吸附特征等方面均进行了一定的研究[4-6]，笔者也从不同类别的钝化剂中选择了秸秆炭、腐殖酸、硅酸钙和蛭石四种钝化剂，通过裸土实验研究了不同钝化剂对亳州地区土壤性质和养分状况的影响。但是，钝化剂对重金属污染土壤的实际修复效果，检验的最终标准应该体现在植物指标上，陈望舒、Zama等也提出应加强钝化材料对植物生长生理等生物学实际效果的研究[7-9]。黑麦草(LoliumperenneL.)生长迅速，易于播种，对重金属耐性较强，在环境治理中具有指导意义[10]。因此，本文通过黑麦草盆栽实验，系统的研究在亳州Cd污染土壤基质中，添加四种钝化剂对黑麦草生长、生理指标的影响，以生物指标评价四种钝化剂对亳州地区土壤Cd污染的钝化效果，为亳州地区Cd污染的钝化修复奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料及仪器

供试土壤为安徽省亳州市近郊某药材种植基地0～20 cm深度的耕作层土壤，土壤基本性质为pH 7.70，有机质含量12.26 g/kg，全氮1.20 g/kg，硝态氮0.031 g/kg，有效磷0.014 g/kg，速效钾 0.179 g/kg。

实验所用秸秆炭(AC)由南京智融联科技有限公司提供，由小麦秸秆在400 ℃条件下限氧裂解获得(专利号：200920232191.9)，腐殖酸(HA)、硅酸钙、蛭石均购自合肥博美药品有限公司。

供试植物1年生黑麦草(LoliumperenneL.)种子由艾通园林有限公司提供。

主要仪器设备：紫外可见分光光度计(上海元析 UV6100)；电导率仪(梅特勒 S230-USP/EP)。

1.2 实验设计

土壤采集后自然风干、除杂，过10目尼龙筛，称取500 g置于花盆中，以溶液形式添加CdCl2使土壤Cd含量(以风干土中的Cd2+计)为5 mg/kg，混合均匀后老化备用。土壤老化15 d后，在四个实验组中分别添加秸秆炭、腐殖酸、硅酸钙、蛭石，每种钝化剂均设置1%、3%、5%三个添加浓度，另设不添加钝化剂的Cd污染土壤一组作为空白对照，以上每种处理均设3组重复，土壤稳定15 d备用。

土壤准备完成后，挑选大小均匀、颗粒饱满的黑麦草种子，每盆播种50粒，待种子出苗后继续培养30 d，培养期间通过重量法保持60%～70%的田间含水量。培养结束后，将黑麦草小心连根取出，自来水冲洗干净后用滤纸吸干备测。

1.3 样品分析

每盆随机抽取15株黑麦草，用刻度尺进行黑麦草根部和地上部分的长度测定，计算耐性指数。

叶片电导率(EL)的测定：将叶片剪成长约1 cm小段置于三角瓶中，按1∶10的比例加双蒸水，以400次/min的速度振荡1 h后，用电导仪测定溶液电导率。

膜脂过氧化物丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法进行测定[11]：取0.5 g鲜叶，加 5 mL5%TCA进行研磨，所得匀浆3000 r/min离心10 min后取上清液2 mL，加 0.67%TBA 2 mL，混匀后沸水浴30 min，冷却后再离心一次，取上清液在450 nm、532 nm、600 nm下测定其吸光度。

叶绿素含量参照李合生的方法[12](P134-P137)：取0.2 g鲜叶剪碎，加少量石英砂、碳酸钙粉和2～3 mL80%丙酮研成匀浆，再加80%丙酮10 mL研磨至组织变白。静置5 min后过滤至25 mL棕色容量瓶定容。以80%丙酮为空白在665 nm、649 nm和470 nm下测定叶片叶绿素提取液的吸光度。

1.4 数据处理

耐性指数(Tolerance Index)= 实验组根系平均长度/对照组根系平均长度变化率(Rn)=(Xn-X0)/X0×100%。其中，X0为空白组指标数值，Xn为各实验组土壤对应指标数值。

所有数据均采用SPSS 17.0统计软件对实验数据进行统计分析，计算平均值、标准差并进行差异显著性分析(LSD法)和相关分析，采用Origin 8.0 进行制图。

2 结果与分析

2.1 四种钝化剂对黑麦草生长指标的影响

茎叶长和根长能直观反应黑麦草的生长状况。从表1可以看出：秸秆炭组茎叶长和根长均值均高于空白组，耐性指数均高于1，且长度指标和耐性指数随秸秆炭添加浓度的上升表现出先上升后下降的趋势，在3%添加量下达到最大值，茎叶长和根长分别比空白高17.70%和21.12%，与空白组存在显著差别(P<0.05)；腐殖酸组、蛭石组和硅酸钙组长度指标和耐性指数则随着钝化剂添加浓度的上升而下降，在1%添加量下，腐殖酸组茎叶长和根长分别比空白高12.47%和16.11%，与空白组差异明显(P<0.05)，蛭石组茎叶长和根长均值也略高于空白，但差异未达到显著程度(P>0.05)，硅酸钙组茎叶长和根长均值普遍低于空白组，当硅酸钙添加量达到3%时，茎叶长和根长均显著低于空白组(P<0.05)，在5%硅酸钙组中，茎叶长和根长比空白组降低了13.08%和19.88%，耐性指数达到最低值0.80。对比同一添加浓度下不同钝化剂对黑麦草的影响，在1%添加浓度下，黑麦草长度指标和耐性指数为腐殖酸组>秸秆炭组>蛭石组>硅酸钙组，但组间差异不显著(P>0.05)，在3%和5%添加量下黑麦草长度指标和耐性指数为秸秆炭组>腐殖酸组>蛭石组>硅酸钙组，3%组中，秸秆炭组长度指标显著高于其他组，5%组中，硅酸钙组长度指标显著低于秸秆炭和蛭石组(P<0.05)。

表1 四种钝化剂对黑麦草生长指标的影响

2.2 四种钝化剂对黑麦草生理指标的影响

2.2.1 四种钝化剂对黑麦草叶片电导率的影响

植物在逆境胁迫下，细胞膜的通透性发生改变，导致胞内电解质渗出，电导率升高。因此，电导率可用于判断细胞膜受害的程度，是衡量植物抗性的重要指标，在植物抗逆性研究中应用十分广泛[13-14]。从图1可以看出，在1%浓度下，电导率表现为腐殖酸组<秸秆炭组<蛭石组<硅酸钙组，但组间差异不显著(P>0.05)，且各钝化剂组电导率均低于空白组。随着钝化剂添加量的提高，秸秆炭组叶片电导率先下降后上升，电导率变化率在3%浓度下达到最小值-9.18%；腐殖酸组、蛭石组和硅酸钙组的电导率则表现出上升趋势，在3%和5%浓度下，电导率均为秸秆炭组<蛭石组<腐殖酸组<硅酸钙组，硅酸钙组电导率水平显著高于秸秆炭组(P<0.05)。

图1 四种钝化剂对黑麦草电导率变化率的影响

2.2.2 四种钝化剂对黑麦草叶片MDA含量的影响

膜脂过氧化水平反应细胞内活性氧的累积程度，影响植物细胞代谢状况[15]，MDA作为膜脂过氧化产物，其含量能反应细胞膜的损伤程度，是衡量细胞膜脂质过氧化程度的重要指标[16]。比较不同钝化剂对黑麦草叶片MDA含量的影响(图2)可以看出：MDA含量在1%浓度下为秸秆炭组<腐殖酸组<蛭石组<硅酸钙组，在3%和5%浓度下为秸秆炭组<蛭石组<腐殖酸组<硅酸钙组。添加活性炭降低了黑麦草叶片细胞中MDA的含量，且降幅在3%秸秆炭组最大，达到20.95%，3%秸秆炭组的MDA水平显著低于同浓度的其他钝化剂组(P<0.05)；腐殖酸和蛭石组MDA含量仅1%浓度下略低于空白，硅酸钙组MDA含量则在各浓度下均高于空白组，且腐殖酸、硅酸钙和蛭石组MDA含量均随着添加浓度的上升而上升，在5%浓度下，腐殖酸、硅酸钙和蛭石组MDA增幅分别达到15.08%、29.54%和10.75%，MDA水平显著高于秸秆炭组(P<0.05)。

图2 四种钝化剂对黑麦草MDA变化率的影响

2.2.3 四种钝化剂对黑麦草叶绿素含量的影响

叶绿素是植物光合作用的重要物质，是植物实现无机物到有机物转化的基础，对植物自身和整个生态系统都具有重要意义。从黑麦草叶片叶绿素在四组钝化剂处理中的变化情况(图3)可以看出：在1%添加浓度下，叶绿素含量为腐殖酸组>秸秆炭组>蛭石组>硅酸钙组，但组间差异不显著(P<0.05)，且各钝化剂组叶绿素含量均高于空白组。除秸秆炭组叶绿素含量随钝化剂添加量先上升后下降，在3%浓度时叶绿素升高19.57%外，腐殖酸组、蛭石组和硅酸钙组叶绿素含量均随钝化剂浓度的上升而下降，在3%和5%浓度下，叶绿素含量分别为秸秆炭组>腐殖酸组>蛭石组>硅酸钙组和秸秆炭组>蛭石组>腐殖酸组>硅酸钙组，秸秆炭组叶绿素含量显著高于硅酸钙组(P<0.05)。

图3 四种钝化剂对黑麦草叶绿素变化率的影响

2.3 黑麦草生长、生理指标的相关性分析

在Cd胁迫下，植物往往表现出细胞膜过氧化水平升高，细胞膜透性增加，电导率上升，光合色素含量下降等现象，植物对Fe、Mn等矿质元素的吸收利用情况也发生变化，从而影响植物的生长和生物量的累积[17]。目前，表征植株对重金属的耐性往往采用耐性指数，常通过计算实验组与空白组根长之比来表示[18]，但是，黑麦草根系较为细弱，在种植过程中不同植株之间根系互相交错，在取材时容易断裂，获得准确数值较地上部分难度更高。通过黑麦草在四种钝化剂环境下的茎叶长、根长、电导率、MDA含量、叶绿素含量的相关性分析(表2)可以看出：黑麦草根长和茎叶长、叶绿素含量三者极显著正相关(P<0.01)，根长、茎叶长、叶绿素含量与MDA含量、电导率极显著负相关(P<0.01)，且电导率负相关程度最高。良好的土壤钝化剂可以通过降低土壤重金属可利用部分降低电导率水平和MDA含量，提高叶绿素的含量，从而促进植株地上、地下部分的生长。因此，采用黑麦草进行土壤Cd污染钝化修复研究时，可以直接以地上部分生长状况表征植株耐性，李希铭等的研究中也发现草坪草地上部分较根系对Cd等重金属更敏感[19]，因此以黑麦草地上部分指标表征其耐受性更简单灵敏。在植株材料有限的情况下，可选择电导率或叶绿素含量来代表黑麦草的生理状况，作为钝化剂对重金属污染修复的首选生物学指标。

表2 黑麦草生长指标、生理指标的相关性分析

3 结论

通过黑麦草盆栽实验，我们发现秸秆炭在1%～5%各添加浓度均能降低黑麦草叶片电导率、MDA含量，提高叶片叶绿素含量，促进黑麦草茎叶、根系的伸长，提高黑麦草的耐性指数，且以3%秸秆炭添加量最佳，MDA含量和茎叶长、根长与同浓度其他钝化剂组存在显著差异；腐殖酸在1%添加量下电导率、MDA含量、叶绿素含量和黑麦草生长指标优于秸秆炭，但当添加量上升到3%后，腐殖酸组黑麦草叶片电导率和MDA含量快速上升，叶绿素含量、茎叶长和根长持续下降；蛭石在1%～3%浓度间，对黑麦草的生长指标和生理指标表现出有利影响，在5%浓度下，对黑麦草生长、生理指标表现出不利影响，但影响程度与其他钝化剂相比较小；硅酸钙仅在1%浓度下使黑麦草电导率降低、叶绿素升高，随着添加量上升，电导率和MDA含量上升，长度指标、耐性指数和叶绿素含量持续下降，对黑麦草的生长表现出不利影响。

从黑麦草生物响应情况来看，在秸秆炭、腐殖酸、硅酸钙、蛭石四种钝化剂中，秸秆炭在所用亳州地区土壤中表现出良好的Cd钝化修复能力，结合成本考虑，以添加量在1%～3%为宜；腐殖酸也有Cd钝化修复的能力，但需要控制在1%左右的低浓度范围，蛭石在Cd钝化修复中作用不够突出，变化幅度小，可以考虑将腐殖酸和蛭石可以作为复合钝化剂的组分进行钝化剂的优化；硅酸钙在本实验中整体表现不利于黑麦草生长的情况，不适合作为亳州地区土壤的Cd污染钝化修复剂。茎叶长、电导率和叶绿素含量均可以作为黑麦草在土壤Cd污染钝化修复效果研究中的首选生物学指标。