补肾疏肝方联合五行音乐对卵巢储备功能减退大鼠的实验研究*

李艳华 ，姜威 ，刘君 ，薛晓鸥

（1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.上海市嘉定区牙病防治所，上海 201800；3.北京中医医院，北京 100010）

卵巢储备功能减退（DOR）是指由于卵巢内可募集的有效卵泡数目减少，或者卵母细胞数量下降，引起月经量减少、月经稀发或者卵巢早衰，从而导致生育力下降的的现象[1]。DOR是一种女性内分泌紊乱的疾病，致病因素较多，主要包括遗传、环境、免疫、心理、生活习惯等。DOR患者伴有不同程度的心理压力[2]，不良情绪会加重病情的发展。根据中医学理论，可将“卵巢储备功能减退”归类为“不孕”“月经后期”“月经过少”等范畴，主要病机为肾虚，兼有肝郁、血瘀、脾虚等中的一项或多项。其中以肾虚肝郁型最为常见，治疗方法多为补肾疏肝法[3-4]。本团队致力于补肾疏肝法联合五行音乐治疗DOR，并且在临床上已经取得了良好的效果，为进一步探讨其作用机制，开展了一系列的动物实验。研究旨在探讨补肾疏肝方联合五行音乐对卵巢储备功能减退大鼠的效果，报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 将54只性成熟的、有规律动情周期的雌性SD大鼠随机分为空白组、模型组、补佳乐组、中药低剂量加音乐组、中药中剂量加音乐组、中药高剂量加音乐组，每组9只，12周龄，体质量（200±10）g。实验大鼠均购自维通利华实验中心。所有实验均在北京中医药大学实验中心进行。

1.2 试剂与仪器 苏木精-伊红（HE）染色液，促卵泡生成素（FSH）、促黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）放射免疫试剂盒；旷场箱（自制）：长宽各100 cm，高60cm，底部划分25个等面积方格，内面均用黑漆涂黑；三洋制冰机，高速离心机，电子天平，切片机，石蜡包埋机，病理图像采集系统等。

1.3 药品 补肾疏肝方组成：当归15g，熟地黄15g，白芍 15 g，赤芍 15 g，川芎 10 g，党参 15 g，炒白术15 g，菟丝子 15 g，女贞子 15 g，川续断 15 g，玫瑰花15 g，月季15 g；补佳乐，每片1 mg，拜耳医药保健有限公司；雷公藤多苷片，每片10 mg，远大医药黄石飞云制药有限公司。按照人与大鼠剂量换算[5-6]，将补肾疏肝方用蒸馏水分别配成 0.9 g/mL、3.6 Lg/mL、1.8 g/mL的溶液；补佳乐灌胃量为0.09 mg/（kg·d）；雷公藤多苷片灌胃量为50 mg/（kg·d）；每天按照10 mL/kg体积灌胃。药物均购自北京中医药大学东直门医院药房。五行音乐：选用《中国传统五行音乐（正调式）》音乐光盘（中华医学电子音像出版社出版）中的角调、羽调（由中央音乐学院乐团演奏，时长45 min）。操作时，周围环境安静，温度、音量适当，两种调式隔日播放，每日1次，每次45 min，连续21 d。

1.4 模型制备与给药 采用慢性轻度不可预见性应激（CUMS）[7]并稍加改进联合雷公藤多苷片灌胃的方法进行造模，刺激因子包括10种：孤笼喂养；潮湿垫料；夹尾刺激1 min；0℃冰水游泳5 min；禁食 24 h；禁水 24 h；黑白颠倒（黑暗 12 h，白昼 12 h）；45°倾斜鼠笼；禁食水24 h；异物刺激24 h（如硬木棍，碎布片等）。10种刺激随机安排，使大鼠无法预测刺激的发生，每日1次，同时给予雷公藤多苷片50 mg/kg灌胃，连续21 d。空白组不给予以上任何刺激，食水、光照充足，安静喂养。

模型成功后，空白组大鼠正常进食水，模型组给予生理盐水灌胃，每日1次，连续21 d；补佳乐组给予补佳乐0.09 mg/kg灌胃，每日1次，连续21 d；中药低、中、高剂量加音乐组分别给予补肾疏肝中药 0.9 g/mL、3.6 g/mL、1.8 g/mL 灌胃，同时播放五行音乐45 min/次，每日1次，连续21 d。

1.5 观察指标

1.5.1 一般情况 每日观察各组大鼠的一般情况（大便、活动情况、毛色、精神、进食水量）。

1.5.2 动情周期 实验开始后，每日上午10时进行大鼠阴道脱落细胞涂片，用移液器吸取生理盐水30 μL，注入大鼠阴道内并反复抽吸3～5次，将其涂于事先标记好的载玻片上，待晾干后用95%乙醇固定30 min，再用瑞氏-姬姆萨复合染液染色后在光学显微镜下观察脱落细胞的形态，以确定大鼠所处动情周期阶段，通过连续涂片判定大鼠的动情周期的情况，包括正常、延长、停滞和无周期。

1.5.3 行为学检测 糖水实验及旷场实验 所有大鼠单笼喂养，在第1个24 h里，每笼放置两个饮水瓶，均装有1%蔗糖水；在第2个24 h里，每笼放置两个饮水瓶，1个装蔗糖水，另1个装蒸馏水；第3个24 h里，禁食水；开始糖水实验：每笼放置两个50 mL饮水瓶，1个含1%蔗糖水，一个含蒸馏水，1 h后取走两瓶，并称质量。于实验第21、42天给予糖水实验。糖水偏嗜度=蔗糖水消耗量/（蔗糖水消耗量+蒸馏水消耗量）×100%；将大鼠放入自制的旷场箱中，自由活动5 min，计算大鼠在中央格子的停留时间。于实验第21、42天给予旷场实验。

原有的2台80 m3反应槽，1#槽作为一段一次除铜、预除镉反应槽，反应35 min，吹制锌粉加入量为液体铜金属量的80%，置换大部分铜，固液分离，控制一段一次净化后液铜镉比满足1～3，达到最佳的除镉效率。

1.5.4 放射免疫法检测血清性激素 采用放射免疫法检测大鼠血清E2、FSH、LH水平，严格按照试剂盒说明书进行操作，将标准品及样本加标记物抗体后静置，并于4℃环境中温育20 h，3 800 r/min，离心半径180 mm，离心15 min，取沉淀物待测。

1.5.5 计算卵巢指数 取下大鼠卵巢，剥离干净周围组织，称质量。卵巢指数：卵巢指数=卵巢湿质量（mg）/体质量（g）×100%

1.5.6 HE染色观察卵巢形态及卵泡计数 取甲醛固定的卵巢组织，进行脱水、包埋、切片，HE染色后，将组织切片置于光学显微镜下观察卵巢形态、组织结构，并计算各级卵泡数目。

1.6 统计学方法 采用SPSS24.0软件进行数据处理，实验数据采用均数±标准差（±s）表示，组内前后比较采用配对样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况 实验过程中，空白组大鼠始终状态良好，被毛光滑，饮食、饮水正常；模型组大鼠被毛稀松，饮食、饮水均减少。与模型组相比，补佳乐组，中药低、中、高剂量联合音乐组上述表现有所改善。

2.2 大鼠卵巢指数变化情况 与空白组比较，模型组大鼠卵巢指数降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，中药中、高剂量联合音乐组及补佳乐组大鼠卵巢指数差异有统计学意义（P＜0.05），中药低剂量联合音乐组差异无统计学意义（P＞0.05），其中补佳乐组与中药高剂量联合音乐组变化较为明显；与补佳乐组比较，中药低、中、高剂量联合音乐组大鼠卵巢指数变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

表1 各组大鼠卵巢指数（±s）Tab.1 Ovarian index of rats in each group（±s）

表1 各组大鼠卵巢指数（±s）Tab.1 Ovarian index of rats in each group（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 卵巢指数（mg/g，%）空白组 9 49.41±2.66模型组 9 42.17±2.31*中药低剂量联合音乐组 9 44.73±1.58中药中剂量联合音乐组 9 45.68±1.71#中药高剂量联合音乐组 9 47.49±2.17#补佳乐组 9 48.57±1.26#

表2 各组大鼠动情周期、糖水偏嗜度（±s）Tab.2 Estrus cycle and sugar water preference of rats in each group（±s）

表2 各组大鼠动情周期、糖水偏嗜度（±s）Tab.2 Estrus cycle and sugar water preference of rats in each group（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 动情次数（次） 糖水偏嗜度（%）实验第21天 实验第42天 实验第21天 实验第42天空白组 9 4.16±0.31 4.26±0.28 72.36±1.17 77.36±1.17模型组 9 3.27±0.47* 3.67±0.55* 60.31±3.81* 70.47±1.28*中药低剂量联合音乐组 9 3.16±0.52* 3.92±0.19 61.13±2.06* 71.07±1.15中药中剂量联合音乐组 9 3.43±0.28* 4.11±0.25# 60.52±1.41* 71.76±1.59#中药高剂量联合音乐组 9 3.38±0.18* 4.37±0.21# 61.37±1.55* 73.36±1.47#补佳乐组 9 3.19±0.22* 4.33±0.57# 60.76±1.59* 73.41±1.15#

表3 各组大鼠旷场实验结果（±s）Tab.3 Open field test results of rats in each group（±s）

表3 各组大鼠旷场实验结果（±s）Tab.3 Open field test results of rats in each group（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别 动物数 旷场实验（实验第21天） 旷场实验（实验第42天）水平（次） 垂直（次） 水平（次） 垂直（次）空白组 9 81.71±4.27 19.49±1.68 82.58±3.16 18.37±1.72模型组 9 68.59±6.54* 16.27±1.19* 74.48±4.36* 17.31±1.41*中药低剂量联合音乐组 9 67.32±5.43* 16.13±1.24* 78.58±3.86 17.93±1.27中药中剂量联合音乐组 9 67.16±6.28* 15.47±1.57* 79.18±4.39# 18.04±1.12#中药高剂量联合音乐组 9 68.09±4.63* 16.12±1.38* 80.27±3.72# 18.33±1.39#补佳乐组 9 67.37±5.33* 15.87±1.51* 80.16±4.12# 18.47±1.07#

2.4 大鼠E2、FSH、LH情况 ELISA结果显示，与空白组比较，模型组大鼠E2降低、FSH升高、LH升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，中药高剂量联合音乐组和补佳乐组，E2升高，FSH降低、LH 降低，差异有统计学意义（P＜0.05），中药低、中剂量联合音乐组E2升高，FSH降低、LH降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）；中药低、中、高剂量联合音乐组与补佳乐组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 4。

表4 各组大鼠 E2、FSH、LH（±s）Tab.4 E2，FSH，LH of rats in each group（±s）

表4 各组大鼠 E2、FSH、LH（±s）Tab.4 E2，FSH，LH of rats in each group（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

LH（mIU/mL）空白组 9 64.46±6.72 2.17±0.82 4.38±1.62模型组 9 44.39±5.41* 3.86±1.71* 6.17±2.12*中药低剂量联合音乐组 9 53.29±5.74 2.23±1.04 4.36±1.82中药中剂量联合音乐组 9 56.32±5.74 2.41±1.57 4.74±1.17中药高剂量联合音乐组 9 57.57±6.34# 2.36±1.27# 5.67±1.63#补佳乐组 9 54.79±6.72# 2.95±1.14# 4.87±1.42#组别 动物数 E2（pmol/L）FSH（IU/L）

2.5 大鼠卵巢病理情况 空白组，卵巢组织内结构清晰，各级卵泡清晰可见，卵丘形态正常，内见较多卵泡液，颗粒细胞较丰富，间质血管较充盈，未见炎性细胞浸润。模型组，卵巢组织结构欠清晰，卵泡数目少，卵泡液含量较少，颗粒细胞层数减少，卵丘变形，少部分间质血管扩张，可见炎性细胞浸润。西药组与中药高剂量联合音乐组结构较为相似，卵巢组织内结构较清晰，可见初级、次级卵泡，卵丘形态较正常，可见中量颗粒细胞，间质血管较充盈，见极少量炎性细胞浸润。中药低、中剂量联合音乐组差异不明显，卵巢组织内结构较清晰，可见次级卵泡，卵丘形态较正常，可见少量颗粒细胞，见少量炎性细胞浸润。与模型组相比，中药低、中、高剂量联合音乐组和西药组情况有所改善；与补佳乐组比较，中药低、中、高剂量联合音乐组卵巢HE切片结果不明显，见图1。

图1 各组大鼠卵巢组织病理情况（HE染色，×40）Fig.1 Pathological changes of ovarian tissue of rats in each group（HE staining，×40）

3 讨论

卵巢储备功能减退的根本病机为肾虚，补肾疗法在临床上也取得了一定的疗效。研究表明，女性卵巢功能减退与快节奏及高社会压力的生活息息相关，社会心理因素受到越来越多的重视[8]。因此，在DOR的治疗中，除了补肾，还要考虑疏肝、心理疏导。笔者在跟师的过程中也比较多见这类患者，但是对肾虚肝郁型卵巢储备功能下降的实验研究较少，尤其是肾虚肝郁型DOR大鼠模型[9]。因此，本文旨在探索慢性应激状态联合雷公藤多苷片对卵巢储备的功能的影响，以及应用补肾疏肝药物联合音乐治疗，并观察其疗效。

音乐疗法作为心理疗法之一，可以提高大脑皮层神经兴奋性，在一定程度上缓解患者抑郁焦虑的情绪[10]。中医五行音乐，将中医阴阳五行、天人合一理论与音乐有机结合，角、徵、宫、商、羽五种调式分别对应肝、心、脾、肺、肾五脏，音乐的旋律振动与机体的振动产生共鸣，与内在脏腑、情志相吻合，从而达到调畅气机，梳理情志的作用[11]。文章中五行音乐与疏肝药物共同起到疏肝的作用，因此在该实验中，补肾疏肝药物与音乐结合作为一种整体疗法，故而实验分组中未做与音乐的对照。

CUMS法制造动物肝郁模型，是目前比较常用的方法，模型成功率较高，造模过程中死亡率较低[12-13]。本实验中造模结束后，与空白组比较，其余5组大鼠造模后出现动情次数减少、糖水偏嗜度下降、直立及垂直次数减少，差异有统计学意义（P＜0.05），说明慢性复合刺激导致了大鼠的肝郁状态。雷公藤制剂是一类临床应用较为广泛的免疫抑制剂，具有生殖毒性，会对卵巢功能造成不同程度的损伤，常用来建立卵巢功能损伤的模型[14-16]。实验中造模结束后，与空白组比较，各组大鼠出现被毛稀松，饮食、饮水均减少，活动量低等肾虚的表现；模型组大鼠E2下降、FSH于LH均升高，差异显著（P＜0.05），且卵巢内卵泡数目减少，颗粒细胞分级减少，提示大鼠卵巢储备功能下降。因此，CUMS法联合雷公藤多苷片造模，结果显示模型具有肾虚肝郁倾向，也是该类复合模型的初探，以期对此类研究有一定的帮助。

文章运用补肾疏肝法对肾虚肝郁型卵巢储备功能减退大鼠进行干预，治疗后与模型组比较，中药低、中、高剂量联合音乐组与补佳乐组E2均升高，FSH与LH均降低，差异有统计学意义（P＜0.05），提示补肾疏肝药物对肾虚肝郁型卵巢储备功能减退大鼠有一定的疗效。治疗前后组内比较，治疗后补佳乐组、中药高剂量联合音乐组大鼠动情次数增加、糖水偏嗜度升高、水平及直立次数增多，差异有统计学意义（P＜0.05），其余各组大鼠差异无统计学意义（P＞0.05），但中药低剂量联合音乐组大鼠在治疗前后动情次数均增加、糖水偏嗜度均增高、水平及直立次数均增加，提示药物干预对促进模型的恢复有一定的作用。与模型组比较，其余各组卵巢病理切片显示卵泡形态较好，颗粒细胞分级增多，尤其是补佳乐组和中药高剂量联合音乐组，提示补肾疏肝药物联合音乐对促进卵巢功能的恢复有一定的作用，其中以中药高剂量联合音乐组效果明显。

肾主生殖，主藏精，女性的生殖功能依赖于肾精的充盛；肝主疏泄，调畅气机，“女子以肝为先天”，气机顺畅，方能促使肾精滋养全身，气血充足，月水盈亏有序[17]。在临床治疗中，应该注重补肾精、疏肝气，加强心理疏导和生活方式的指导，更好的保护卵巢功能。文章运用补肾疏肝药物联合五行音乐对肾虚肝郁型卵巢储备功能减退大鼠进行疗效观察，疗效确切，但作为对该复合模型的初探，尚有一些不足之处，比如实验条件控制的严格与否、有没有有效验证复合模型的指标等，需要进一步研究，以期为临床治疗女性卵巢储备功能下降提供一些思路。