基因调控网络与先天性巨结肠发生的相关研究进展

韩璐，姜茜

(首都儿科研究所遗传研究室，北京 100020)

先天性巨结肠(在线人类孟德尔遗传数据库编码，OMIM：142623)是由神经嵴细胞增殖、分化或迁移异常所致的一种多基因遗传病[1-2]。其临床表现为肠道蠕动能力减弱、低位肠梗阻、顽固性便秘、腹胀等，部分病例伴有并发症，严重者不及时治疗可导致死亡；主要病理特征为肠道神经节细胞缺失[3]。根据受累肠段的范围不同先天性巨结肠可分为短段型(神经节细胞缺失的肠段不超过乙状结肠近端)、长段型(痉挛狭窄段延至降结肠甚至横结肠)和全结肠型(痉挛狭窄段波及升结肠及距回盲部30 cm以内的回肠)[2]。来自迷走神经或骶神经的神经嵴细胞需要经过一系列基因表达调控最终分化为神经元和胶质细胞，由其组成的复杂系统构成肠神经系统[4-5]。肠道神经元及其前体细胞谱系的适度增殖、平衡分化以及顺利迁移是肠神经系统正常发育的前提条件[6]，这一过程涉及复杂的基因调控网络，其中关键基因发生的编码区突变或非编码区单核苷酸多态性风险等位基因累积所致的基因表达异常等均可导致先天性巨结肠的发生。明确先天性巨结肠疾病的致病基因有利于为先天性巨结肠的预防、诊断、治疗方案提供充分的证据，为疾病再发风险相关遗传咨询提供科学的指导。现就基因调控网络与先天性巨结肠发生的相关研究进展进行综述。

1 肠神经系统发育早期的细胞增殖与分化

1.1以性别决定区盒基因10(SRY-box transcription factor 10，SOX10)为核心的基因表达调控网络 SOX10是一种重要的转录因子，参与调节胚胎发育和细胞命运决定过程。其编码的蛋白质在与其他蛋白质形成复合物后可作为转录激活剂，该蛋白作为一种核质穿梭蛋白，对神经嵴细胞和外周神经系统发育具有至关重要的作用。Taylor等[7]发现神经嵴细胞早期表达SOX10，并对Notch和内皮素3/G蛋白偶联内皮素受体信号通路做出反应，这些因子使祖细胞在增殖的过程中始终保持未分化状态，见图1。SOX10、内皮素受体B基因(endothelin receptor type B，EDNRB)、内皮素3基因突变会导致严重的综合征型先天性巨结肠(OMIM：277580)，患者的典型表现是皮肤或虹膜色素沉着异常、感音神经性耳聋伴先天性巨结肠[8-9]。Sribudiani等[10]指出，SOX10还会与SUFU刺猬信号负调节基因(SUFU negative regulator of hedgehog signaling，SUFU)、神经胶质瘤原癌基因家族(glioma-associated oncogene homolog，GLI)构成基因调控环路，调节神经嵴细胞的分化和迁移。其中，SUFU编码Hedgehog信号通路的负调控因子与模式生成和细胞增殖有关。GLI1编码的转录因子被Shh信号转导级联激活，调节干细胞的增殖。Han等[11]发现Shh信号在人类胎儿器官形成期会与Wnt信号一起触发并决定包括肠道在内的多种器官的形成方式和形成时间。GLI3作为DNA结合转录因子，是Shh信号转导的重要介质，与胚胎发育密切相关[12]。Liu等[13]对先天性巨结肠患者的深度靶向测序发现了GLI1、GLI2、GLI3、SUFU、SOX10基因的多种突变。Matera等[14]利用N-乙基-N-亚硝基脲突变筛选实验发现Gli3可作为Sox10神经损伤的修饰因子，在小鼠胚胎期第11.5天，Gli3的无义突变虽然不会影响野生型小鼠的正常发育，但会显著增加Sox10基因缺陷小鼠异常表型的严重程度，包括黑色素细胞减少和肠神经系统发育障碍。该研究也表明，在决定表型严重程度时，主要致病基因的作用可以被特定修饰因子调节。Sufu是Gli的关键负向调控因子[15-16]，Sufu突变体中Gli的转录活性得到明显增强进而导致祖细胞状态不稳定，促进肠神经嵴细胞的分化。Gli家族分子的活性直接决定最终肠神经系统中神经元与胶质细胞的比例，Sufu突变会增加Gli转录活性，导致胶质细胞比例增加，神经元比例降低[13]，见图1。

1.2以印度刺猬信号分子(Indian hedgehog signaling molecule，IHH)基因和锌指E盒结合同源蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)基因为核心的基因表达调控网络 IHH基因也参与编码Hedgehog家族分子的蛋白质。转录因子GLI3编码IHH的中间体，GLI3和IHH基因编码区的错义突变均已在部分先天性巨结肠患者中被检测到[10]。Sribudiani等[10]发现向斑马鱼胚胎内注射IHH阻断剂吗啉代后，其肠道神经元的数量明显减少，说明IHH可调控肠道神经元的发育。

ZEB2在神经嵴细胞分化为具有双向潜能的祖细胞之前的胚胎发育早期作为转录因子调节神经、神经外胚层和中胚层谱系的发育[17]。ZEB2基因单倍剂量不足会导致源自神经和神经外胚层谱系的综合征，包括先天性巨结肠、智力低下、面容异常等特征，即Mowat-Wilson综合征(OMIM：235730)[18-19]。Birkhoff等[20]研究表明，ZEB2的表达有时间和组织特异性，转录因子SOX10和HOXB2通过与ZEB2基因上的3个增强子结合参与这种特异性的调控。

2 肠神经系统发育中期的细胞增殖与分化

2.1成对样同源框2B(paired like homeobox 2B，PHOX2B)基因与SOX10基因调控细胞分化方向 PHOX2B基因3号外显子内丙氨酸重复扩增突变是导致先天性中枢性低通气综合征的主要原因[20]。先天性中枢性低通气综合征患者发生先天性巨结肠和神经母细胞瘤的概率分别是正常人群患病率的1 000倍和500～1 000倍[21]。在合并先天性巨结肠和神经母细胞瘤的先天性中枢性低通气综合征患者中，多数携带PHOX2B基因的错义突变或由碱基插入、缺失引起的移码突变[22]。Young等[23]发现，在小鼠体内，迷走神经或骶神经嵴细胞来源的未分化的祖细胞在进入前肠间质时即开始持续表达Phox2b、酪氨酸激酶受体原癌基因Ret等。Nagashimada等[24]通过在小鼠Phox2b基因座中引入非丙氨酸重复扩增突变(931 del5；693-700 del8)，成功诱导出与先天性巨结肠和神经母细胞瘤患者相似的异常表现。该突变降低了野生型Phox2b在其已知靶点多巴胺羟化酶上的转录激活效应，将Phox2b对Sox10增强子的转录作用从转录阻遏转变为转录激活，使Sox10的表达量显著升高。从胚胎第15天开始，双潜能祖细胞开始分化为胶质细胞(Phox2b-,Sox10+)或神经细胞(Phox2b+,Sox10-)；至胚胎第12天，TuJ1+神经元前体细胞应停止表达Sox10，但在突变型小鼠的TuJ1+神经元前体细胞中Sox10仍持续高表达，提示Phox2b基因的这一功能获得性突变和由此所致的Sox10基因表达异常升高可能与先天性巨结肠的易感性增加有关[24-25]，见图1。

PHACTR4：磷酸酶和肌动蛋白调控因子4；ROCK：Rho相关蛋白激酶；PPI：蛋白激酶1；Itgb1：整合素亚基β1；COL6A：Ⅵ型胶原蛋白α链；PHOX2B：成对样同源框2b；SOX10：性别决定区盒基因10；RET：酪氨酸激酶受体原癌基因；ET-3：内皮素3；ETB：G蛋白偶联内皮素受体；NGFR：神经生长因子受体；Ki67：由单克隆抗体ki67鉴定的抗原；EDNRB：内皮素受体B；EDN3：内皮素3基因；GLI3：神经胶质瘤原癌基因家族3；SUFU：SUFU刺猬信号负调节基因；Ascl1：achaete-scute family bHLH transcription factor 1；PTCH1：补丁基因1；DLL3：Delta样经典Notch配体3；GDNF:神经胶质细胞来源的神经营养因子；GFRα1：神经胶质细胞来源的神经营养因子家族受体α1；CBL：卡西塔斯B系淋巴瘤原癌基因；GATA2：GATA 结合受体2；NKX2-5：NK2同源框5；RARB：视黄酸受体β；GFAP：胶质纤维酸性蛋白；HuC/D：RNA结合蛋白HuC/RNA结合蛋白HuD；Tuj1：Ⅱβ-Tubulin

2.2Hedgehog/Notch诱导的过早胶质细胞生成 肠道胶质细胞过早生成可通过降低神经嵴细胞祖细胞的比例减少神经元数量。Ngan等[26]对先天性巨结肠患者的全基因组关联分析发现，补丁基因1(patched 1，PTCH1)和Delta样经典Notch配体(Delta like canonical Notch ligand,DLL)3基因内的系列特定单核苷酸多态性与较高的发病风险相关。小鼠肠神经嵴细胞中Ptch1的缺失可诱导Dll1高表达和Notch信号通路的激活，导致突变肠道中过早生成胶质细胞和肠神经嵴细胞祖细胞的减少[26]。Dll1是Hedgehog的配体，在肠神经系统发育过程中发挥整合Hedgehog、Notch通路以协调神经细胞和胶质细胞分化水平的作用。此外，Hedgehog家族分子功能异常还与人类神经嵴细胞相关前体细胞来源的神经胶质瘤形成有关。因此认为，PTCH1和DLL3是先天性巨结肠的疾病易感基因，Hedgehog/Notch诱导的过早胶质细胞生成可能是先天性巨结肠的发病机制之一，见图1。

2.3以RET为核心的基因表达调控网络 神经胶质细胞来源的神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor，GDNF)-GDNF家族受体α1(GDNF family receptor-α1，GFRα1)-RET信号通路对双潜能祖细胞的增殖、分化、迁移均有重要作用，见图1。RET基因编码的受体在神经系统发育以及神经嵴衍生的器官和组织发育中发挥重要作用。GDNF基因编码其配体，GFRα1基因编码共受体。实验表明，GDNF可通过调控祖细胞的增殖来控制肠道神经元的数量，在Gdnf纯合缺失小鼠中，肠道广泛出现神经元缺失，但是胃和食管神经元的数量均未受到影响[27]。食管神经元、一过性儿茶酚胺能细胞、由一过性儿茶酚胺能细胞发育而成的神经细胞均为Ascl1(achaete-scute family bHLH transcription factor 1)依赖的，而肠道神经元和胶质细胞是非Ascl1依赖的，尽管它们都起源于迷走神经或骶神经嵴的祖细胞[1,7,28]，见图1。部分先天性巨结肠患者携带GDNF突变；利用HEK293细胞系进行的体外实验表明，GDNF的缺失抑制了其基因产物的分泌，RET表达水平亦显著下降[10]。Soret等[29]使用GDNF对具有先天性巨结肠表型的出生后小鼠进行灌肠治疗，观察到肠道神经元(肠肌层HuC/D+神经元)和胶质细胞(Sox10+)再生以及肠道蠕动功能显著恢复；向从先天性巨结肠患者体内分离培养的病变段结肠组织中添加GDNF也能观察到神经元的明显再生现象；此外，神经相关施旺细胞(Ki67+SOX10+)作为肠神经元和胶质细胞的前体，其增殖和迁移作用也得到显著恢复。

先天性巨结肠的主要致病基因RET编码一种跨膜酪氨酸激酶，当其配体GDNF与共受体GFRα1结合时可被激活[30]。RET基因功能异常主要由编码区罕见变异及非编码区常见增强子变异引起，这些变异可在至少48.4%的先天性巨结肠患者中被检出[2]。其中，至少90%的短段型先天性巨结肠患者携带RET基因非编码区变异[31]，约35%的长段型先天性巨结肠患者携带RET基因编码区罕见变异。Lai等[32]发现长段型先天性巨结肠患者来源的人诱导多能干细胞RET G731del细胞系表现出明显的迁移障碍和肠道神经元分化异常，突变修正后，迁移和分化能力均得到显著恢复。RET所在的复杂基因调控网络是先天性巨结肠发生的关键限速步骤，这一过程也涉及非自主因素，如GDNF不是由肠神经嵴细胞表达，而是由肠道间充质细胞表达[33]，见图1。Emison等[34]认为RET内含子在基因调控网络中也发挥作用：内含子区变异可通过改变RET基因表达量增加先天性巨结肠的发生风险。以RET基因内含子中的单核苷酸多态性位点rs2435357为例，在先天性巨结肠患者队列检出“T”等位基因的频率远高于正常人群。该风险等位基因可通过破坏SOX10与增强子的结合作用降低RET的信使RNA表达，使先天性巨结肠的发病风险增加4倍。Kapoor等[35]发现在欧洲高加索患者中，RET(rs2435357、rs2506030)和轴突导向因子3A(rs11766001)基因内部的3个常见、低外显率的非编码区变异可导致短段型先天性巨结肠的发病风险显著增加，风险等位基因的效应与患者所携带的风险等位基因数量成正比，具有累加效应。Chatterjee等[33]对8对人类胎儿肠组织进行的实验表明，RET基因内3个非编码区增强子rs2506030、rs7069590 和rs2435357分别结合转录因子视黄酸受体β、GATA结合受体2(GATA binding protein 2，GATA2)和SOX10，“A-T-T”“G-T-T”单体型对应的RET基因表达最低，同时，GDNF、GFRα1表达增高，卡西塔斯B系淋巴瘤原癌基因、SOX10、GATA2表达降低，视黄酸受体β表达不变。不同的增强子基因型组合可不同程度地影响RET基因的表达水平以及部分RET以外的基因，说明这些效应可能还通过其他顺式作用调控元件和增强子发挥作用[33]。

2.4以EDNRB为核心的基因表达调控网络 EDNRB是基因表达调控网络中的另一关键基因(图1)，Chatterjee和Chakravarti[36]实验表明，EDNRB基因的转录因子至少包括GATA2、SOX10和NK2同源框5三种，可分别结合EDNRB基因的3个增强子：E9(chr13:78481415-78482733)、E10(chr13:78493407-78494720)和E7(chr13:78439541-78440595)。小鼠实验结果提示Ednrb、Gata2、Sox10可正向调控Ednrb的表达；人类样本检测结果证实EDNRB表达下降到一定程度时会降低SOX10、GATA2的表达水平；其中，关键基因对转录因子的表达变化更加敏感。转录因子SOX10和GATA2是EDNRB和RET基因的共有转录因子，EDNRB与RET的表达也可互相影响。在基因表达调控网络内，基因表达水平除受顺式调控元件的调控外，还与多种表观遗传学因素有关，包括DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰、多梳抑制、ATP依赖的染色质重塑和非编码RNA等[37-39]，但是目前这方面可靠的实验证据较少，不能直接证明表观遗传学因素参与先天性巨结肠的致病机制。

目前，大量基因均已被证实与先天性巨结肠的发生相关[40]，但它们在基因表达调控网络中的准确位置及相互调控关系尚不清楚。黏着斑蛋白(vinculin，VCL)基因编码与细胞-细胞和细胞-基质连接相关的细胞骨架蛋白，它与包括踝蛋白、肌动蛋白和桩蛋白在内的蛋白质结合后发挥作用。Lai等[32]观察到携带VCL p.Met209Leu突变的短段型先天性巨结肠患者来源的诱导多能干细胞表现出迁移异常和向肠神经元谱系分化能力受限的现象，提示VCL可能也是神经嵴细胞分化迁移的调控基因之一。Gui等[40]对长段型先天性巨结肠患者的全外显子组测序后发现，患者携带DENN功能域包含基因3、NCLN(nicalin)、NUP98(nucleoporin 98 and 96 precursor)或TBATA(thymus,brain and testes associated)突变。其中，NCLN在结肠呈特异性高表达；NUP98编码核孔复合体，参与众多细胞生理过程，包括核输入/输出、有丝分裂进程和基因表达调控；TBATA则可能与神经元形态发生有关。排除基因编辑脱靶效应后，经斑马鱼吗啉代基因敲低实验和CRISPR/Cas9敲除实验表明，这4个基因中任何一个发生缺陷都会导致斑马鱼肠道远端神经节细胞的缺失。

3 细胞迁移

3.1磷酸酶和肌动蛋白调控因子4(phosphatase and actin regulator 4，PHACTR4)基因通过细胞自主作用控制细胞迁移 肠神经嵴细胞迁移障碍也可导致人类肠道远端神经节细胞缺失，这种迁移障碍可能通过细胞自主作用或细胞非自主作用两种机制形成。PHACTR4(MIM：608726)通过细胞自主作用影响肠神经嵴细胞在肠道间充质中的迁移活动，见图1。Zhang等[41]发现Phactr4基因功能缺陷会导致小鼠胚胎结肠神经节细胞缺失；延时成像显示胚胎发育期肠道内的肠神经嵴细胞发生细胞群迁移缺陷；同时，突变的肠神经嵴细胞出现随意的细胞突起以及定向、连锁性迁移中断等现象。Phactr4编码蛋白与整合素和丝切蛋白在细胞突起处共定位，通过Rho/ROCK途径负调控整合素信号，并通过协调蛋白磷酸酶1与丝切蛋白活性来调节细胞骨架动力学[42]。Zhang等[41]的实验表明，板状伪足的形成和体内肠神经嵴细胞连锁性迁移缺陷均可通过抑制ROCK和整合素的功能获得特异性挽救。

3.2基因整合素亚基β1和Ⅵ型胶原蛋白α链(collagen type Ⅵ alpha chain，COL6A)的产物通过非细胞自主作用影响细胞迁移 细胞外基质成分异常也会阻碍肠神经嵴细胞在肠道间充质内的迁移活动，这是一种细胞非自主作用，见图1。细胞外基质有支架作用，可通过与分泌型配体或跨膜受体相互作用来影响包括迁移、增殖、存活和(或)分化在内的一系列细胞行为[17-18]。细胞外基质出现异常的模式动物中肠神经嵴细胞往往不能完成在后肠的定植，其原因包括：①Breau等[43]证明整合素是细胞外基质的主要黏附受体，编码整合素亚基β1基因缺失导致细胞外基质内肌腱蛋白C、纤维连接蛋白表达增加，肠神经嵴细胞对肌腱蛋白C的抑制作用增强，而对纤维连接蛋白的刺激作用不敏感；②Akbareian等[44]证明细胞外基质糖蛋白腱鞘蛋白C在肠神经嵴细胞进入盲肠后表达，具有促进肠神经嵴细胞迁移作用，若表达缺失会导致肠神经嵴细胞迁移受限。

此外，细胞外基质中胶原蛋白Ⅵ的含量也会影响肠神经嵴细胞的迁移，见图1。Soret等[45]发现先天性巨结肠小鼠模型“Holstein”的Col6a4基因表达水平上调，发育中和出生后细胞外基质中的总胶原蛋白Ⅵ水平显著升高，肠神经嵴细胞迁移明显受阻。Heuckeroth[46]指出COL6A1和COL6A2位于人类第21号染色体长臂，并在21-三体综合征胎儿皮肤中过表达；可能单独与COL6A3相互作用，形成经典的α1-α2-α3三聚体胶原蛋白单体。Nishida等[47]利用小鼠实验表明，胶原蛋白Ⅵ可抑制纤维连接蛋白诱导的肠神经嵴细胞迁移、扩散，形成扩散形态较窄、应力纤维形成较弱的肠神经嵴细胞；在含有人Ⅵ型胶原蛋白的培养板上培养的肠神经嵴细胞中，局部黏附复合体成分p130Cas的表达水平和磷酸化程度均明显降低。COL6A1为先天性巨结肠风险基因，与唐氏综合征患者的先天性巨结肠高度易感相关[45]。

4 环境因素改变风险等位基因外显率

先天性巨结肠是基因与环境因素共同致病的复杂人类遗传病，遗传因素的贡献度虽大于80%[2]，但环境因素也是不可忽视的重要病因之一，见图1。Lake等[48]证明了麦考酚酯作为环境因素导致先天性巨结肠的假设。麦考酚酯是鸟嘌呤核苷酸的生物合成抑制剂，可损害斑马鱼肠神经系统的发育，还可选择性地损害小鼠肠神经系统前体细胞的增殖、延迟其迁移并最终诱发肠道无神经节细胞的症状。体外实验中，麦考酚酯的处理也可明显抑制肠神经系统前体细胞的生存和增殖，并缩短细胞迁移距离。有研究对嘌呤回收基因次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的X-失活处理嵌合体的实验发现，麦考酚酯通过减少肠神经系统前体细胞增殖的机制诱导细胞迁移缺陷和无神经节细胞症的类似症状[48]。研究显示，一些临床上重要的抗代谢应激类药物(如叶酸)、维生素B12缺乏、抗叶酸类药物(如甲氧苄啶和甲氨蝶呤)和其他抗代谢物(如硫唑嘌呤和6-巯基嘌呤)均可增加先天性巨结肠的易感性[48-49]，提示环境因素可能通过增加某些遗传变异的外显率加重先天性巨结肠的病理表型。

5 小 结

现已明确先天性巨结肠的发生与肠神经嵴细胞增殖、分化、迁移异常密切相关，异常的原因包括：①环境因素与遗传和表观遗传学因素；②细胞自主性作用与细胞非自主性作用；③基因编码区罕见突变，包括功能获得性突变或功能丧失性突变(单倍剂量不足、显性负效应等)与基因非编码区顺式调控元件变异所致的基因调控网络功能异常。目前，约72%的先天性巨结肠患者能检测到较为明确的遗传学易感因素，另外仍有28%的患者发病原因尚不明确[2]。未来，应更加关注基因组内非编码区单核苷酸多态性及其所在的基因调控网络中多种风险等位基因的累加效应对先天性巨结肠发生所起的作用[50]，以深入地理解该病的发病机制。