4种吴茱萸属植物叶片和果实的乙醇提取物及其体外抗肿瘤活性

靳 桐，印 敏，管福琴，李冬玲，佟海英，冯 煦，单 宇，①，王奇志，①

〔江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园)：a.江苏省植物资源研究与利用重点实验室，b.江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京210014〕

吴茱萸属(EvodiaJ.R.et G.Forst.)植物的提取物及单体化合物不仅具有镇痛抗炎[1]、改善胃肠道功能[2]、保护心血管[3]和治疗阿尔茨海默病[4]等作用，还具有抑制乳腺癌[5]、结肠癌[6]、肝癌[7]和黑色素瘤[8]等肿瘤相关疾病的药理活性。目前，对吴茱萸属植物的研究主要集中在《中华人民共和国药典》中收录的吴茱萸〔E.rutaecarpa(Juss.)Benth.〕、石虎〔E.rutaecarpavar.officinalis(Dode)Huang〕和疏毛吴茱萸〔E.rutaecarpavar.bodinieri(Dode)Huang〕3种基源植物[9]。本课题组前期对吴茱萸属植物的资源调查和化学成分动态分析等方面进行了研究[10-12]。依据亲缘关系和生源合成途径，同属植物在化学成分和药理活性方面具有相似性[13]。

鉴于此，本文以云南吴萸(EvodiaailanthifoliaPierre)、华南吴萸(E.austrosinensisHand.-Mazz.)、臭檀吴萸〔E.daniellii(Benn.)Hemsl.〕和丽江吴萸(E.delavayiDode)为研究对象，通过回流提取和分段萃取的方法获得4种植物叶片和果实的不同极性提取物，采用MTT法测定各提取物对3种肿瘤细胞(包括乳腺癌细胞MDA-MB-231、结肠癌细胞LoVo和肝癌细胞HepG2)增殖的抑制率，并考察其对正常细胞(人主动脉平滑肌细胞HASMC)的毒性作用，从而评价其安全性，以期探究这4种吴茱萸属植物的药理活性，并为中药吴茱萸的同属植物资源在医药方面的综合利用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

云南吴萸、华南吴萸和丽江吴萸于2014年10月采自云南西双版纳，臭檀吴萸于2014年9月采自江苏连云港。参照LY/T 1211—1999 中的方法，在植物停止生长前1个月左右，分别从每种植物同一植株树冠中上部向阳面采集适量叶片和果实。以上植物样品均由江苏省中国科学院植物研究所袁昌齐研究员鉴定，植物标本保存于江苏省中国科学院植物研究所天然产物化学研究中心。

乳腺癌细胞MDA-MB-231、结肠癌细胞LoVo、肝癌细胞HepG2及人主动脉平滑肌细胞HASMC购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。高糖型DMEM培养基(1×)、1640培养基(1×)、胎牛血清(FBS)和青霉素-链霉素购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 提取方法 取上述4种吴茱萸属植物的叶片和果实，于55 ℃烘干至恒质量，各取300 g，按料液比(m∶V)1∶8加入体积分数80%乙醇，回流提取3次，每次3 h，抽滤后合并滤液，分别用R-100旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)减压浓缩至流浸膏300 mL，取5 mL作为总提取物留样；然后分别依次加入150 mL二氯甲烷和乙酸乙酯，于48 ℃水浴旋转热萃取3次，每次10 min，分别合并萃取液并浓缩，于55 ℃烘干至恒质量，分别得到二氯甲烷部位和乙酸乙酯部位，剩余浸膏于55 ℃干燥至恒质量作为水部位。以上浸膏各取0.1 g，用二甲基亚砜(DMSO)配置成质量浓度10 mg·mL-1的溶液。测定前，将其加入含体积分数10%胎牛血清的培养基中，稀释至给药浓度10 μg·mL-1。

1.2.2 细胞增殖抑制率的测定方法 MDA-MB-231、HepG2和HASMC细胞培养于含体积分数10%胎牛血清和体积分数1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，LoVo细胞培养于相同方法配制的1640培养基中，然后置于体积分数5% CO2、温度37 ℃、饱和湿度的细胞培养箱中培养，每隔1 d更换培养液进行细胞传代。取处于对数生长期的细胞进行活性测定，调整细胞浓度为1×105mL-1，接种于96孔板，每孔100 μL细胞悬浮液。阳性对照组为10 mg·mL-1吴茱萸碱(EVO)，溶剂为DMSO；空白对照组为不含药物的DMSO。给药组和阳性对照组均用培养液稀释至100 μg·mL-1，空白对照组进行同等倍数的稀释，每孔加药体积均为10 μL，使最终给药浓度为10 μg·mL-1。将96孔培养板置于37 ℃培养箱中孵育72 h；然后向各孔中加入10 μL 5 mg·mL-1MTT(溶剂为PBS缓冲液)，置于培养箱中继续孵育4 h后吸出培养液，向各孔加入100 μL DMSO，振摇10 min。用Infinite M200酶标仪(瑞士Tecan公司)在波长570 nm处测量每孔的吸光度(OD)。实验设置3次重复。

1.3 数据处理和分析

根据公式“各部位提取率=(各部位浸膏质量/原植物样品干质量)×100%”计算各部位样品的提取率。根据公式“细胞增殖抑制率=(1-给药组或阳性对照组的OD值/空白对照组OD值)×100%”计算样品对细胞的增殖抑制率。采用SPSS 22.0统计分析软件对实验数据进行统计和分析。

2 结 果

2.1 4种吴茱萸属植物叶片和果实提取物的提取率

结果表明：4种吴茱萸属植物叶片和果实体积分数80%乙醇总提取物(以下简称总提取物)的提取率在13.00%～30.35%之间，其中，云南吴萸果实的提取率最高(30.35%)，臭檀吴萸叶片及丽江吴萸叶片和果实的提取率均高于20%。

2.2 对肿瘤细胞增殖的抑制作用

在10 μg·mL-1给药浓度下，吴茱萸属4种植物叶片和果实总提取物及其二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位和水部位对3种肿瘤细胞及1种正常细胞增殖的抑制率见表1。结果显示：云南吴萸叶片总提取物及其水部位、华南吴萸果实总提取物的乙酸乙酯部位以及臭檀吴萸果实总提取物对乳腺癌细胞MDA-MB-231和肝癌细胞HepG2的抑制率均高于50%，云南吴萸叶片总提取物的二氯甲烷部位对3种肿瘤细胞的抑制率均高于50%，云南吴萸叶片总提取物的乙酸乙酯部位对乳腺癌细胞MDA-MB-231和结肠癌细胞LoVo的抑制率均高于50%，且对正常的人主动平滑肌细胞HASMC的抑制率均低于40%，表明其对肿瘤细胞的选择性较好，可作为天然抗肿瘤物质资源。

表1 4种吴茱萸属植物叶片和果实乙醇提取物对细胞增殖的抑制率

本研究得到的是粗有效提取物，由于粗有效提取物中化学成分较复杂，具体发挥药效的是哪一种或哪几种成分还有待进一步分离、纯化及结构鉴定，其有效部位的提取工艺也有待进一步研究。此外，MTT法只适用于抗肿瘤前体药物的体外初筛实验，有效提取物的抗肿瘤活性还有待通过动物体内实验和进一步的机制探究进行验证。