麦冬有效部位提取及对支原体感染小鼠肺组织免疫调节作用

孙 妍，王 静，侯 喆，綦 菲，王伟明

（黑龙江省中医药科学院，哈尔滨 150036）

麦冬为百合科沿阶草属多年生常绿草本植物，麦冬味甘、微苦，性微寒，归胃、肺、心经，有养阴润肺、益胃生津、清心除烦的功效，用于肺燥干咳、阴虚痨嗽、喉痹咽痛、津伤口渴、内热消渴、心烦失眠、肠燥便秘等症,是中药滋阴润肺常用药。《神农本草经》将麦冬列为养阴润肺的上品，言其“久服轻身，不老不饥”。现代研究表明，麦冬块根中富含有多糖、皂苷、黄酮等有效成分，具有抗心肌缺血、抗心律失常、保护心肌、抗血栓形成、抗炎、降血糖、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫、改善肝肺损伤及镇咳等药理作用[1-2]。

肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）引起的呼吸道感染性肺炎[3]。儿童肺炎支原体肺炎的主要临床特征为反复高热、顽固性干咳、少痰或痰黏难咯等，从病机角度为外感风热燥毒所致“肺燥咳嗽”，属于燥邪犯肺的范畴[4]。临床上提出了从燥论治小儿支原体肺炎，以“养阴清肺，润肺止咳”为其主要治则，取得了较好疗效[5-7]。

1 实验材料

98-1-B 型电子调温电热套购于天津市泰斯特仪器有限公司；RE52-3 旋转蒸发仪购于上海沪西分析仪器厂有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵购于郑州长城科工贸有限公司；DZF-6210 型真空干燥箱购于上海雷韵仪器制造有限公司；UⅤ-160A 紫外可见分光光度计购于日本岛津公司；电热恒温水浴锅购于上海精宏实验设备有限公司；BSA22AS-CW 电子天平购于Sartorim 公司；LGJ-10F 冷冻干燥机购于北京松源华兴科技发展有限公司。95%乙醇（批号：20130109）、无水乙醇（批号：20130422）、乙醚（批号：20130715）、氯化钠（批号：20130319）、正丁醇（批号：20130522）购于天津市科密欧化学试剂有限公司；氯仿（批号：20121013）购于天津市博迪化工有限公司；丙酮（批号：20130325）购于天津市化学试剂六厂分厂；硫酸（批号：20110107）购于西陇化工股份有限公司；葡萄糖（批号：F20120815）购于国药集团化学试剂有限公司；蒽酮（批号：20120313）购于北京化工厂；麦冬药材（批号：130109）购于河北安国振宇药业有限公司；鲁斯可皂苷元（批号：L-009-130730）购于成都瑞芬思生物科技有限公司；牛血清白蛋白（批号：F20100405）购于中国医药（集团）上海化学试剂公司；氢氧化钠（批号：20090613）购于天津市大陆化学试剂厂；考马斯亮蓝（进口分装）购于美国sigma 公司；D101 大孔树脂（批号：20130421）购于天津市汇达化工有限公司；磷酸（批号：20120207）购于西陇化工股份有限公司。

2 实验方法

2.1 麦冬总皂苷的提取工艺麦冬饮片加10 倍量75%乙醇加热回流提取3 次，每次2 h，提取液回收乙醇得到浸膏后，经过D101 大孔树脂柱，收集70%乙醇洗脱液，洗脱液回收乙醇后冷冻干燥，得麦冬总皂苷。

2.1.1 标准曲线制定精密称取鲁斯可皂苷元对照品，加甲醇制成每1 mL含50 μg的溶液。精密吸取0.5、1、2、3、4、5、6 mL 标准液置于具塞试管中，于水浴中挥干溶剂。精密加入10 mL 高氯酸，摇匀，置热水中保温15 min，取出，冰水冷却，高氯酸为空白，用紫外-可见分光光度法，在397 nm 波长处测定吸光度。以浓度为横坐标（X），吸光值为纵坐标（Y），绘制标准曲线。

2.1.2 正交试验根据前期单因素试验结果，以皂苷提取率为考察指标，选取乙醇浓度、提取次数、提取时间作为考察因素，各取3 个水平，进行L9（34）正交试验设计，以确定麦冬皂苷提取的最佳工艺。因素水平见表1。

表1 因素水平表

2.1.3 麦冬皂苷纯化动态吸附试验的单因素考察取预处理的3 根D101 大孔吸附树脂柱，每根柱装30 g树脂，通过吸附时间、上柱体积、洗脱剂浓度及洗脱剂用量考察各因素对树脂吸附效果及麦冬总皂苷含量的影响。单因素试验设计见表2。

表2 单因素试验设计

2.2 麦冬多糖提取分离麦冬饮片加10 倍量75%乙醇加热回流提取3 次，每次2 h，提取后挥干乙醇得干燥的麦冬药渣，经水提醇沉、依次用无水乙醇、乙醚、丙酮洗涤，洗涤后减压得到粗多糖粉末，用sevage 法脱蛋白，得麦冬多糖。

2.2.1 对照品溶液的配制将干燥至恒重的葡萄糖对照品配成0.2 mg/mL 的葡萄糖标准溶液。分别精密吸取标准液1、2、3、4、5 mL 置于10 mL 容量瓶中，以蒸馏水定容摇匀，得系列对照品溶液。

2.2.2 标准曲线的制备精密吸取上述系列对照品溶液1.0 mL，分别置于10 mL 具塞试管中，将试管置于冰水中，在冰水中分别向试管中加入0.2%蒽酮-硫酸溶液4 mL，待各管加完后同时摇匀，置于沸水浴中加热10 min，取出，迅速冷却至室温，放置10 min，于627 nm 处测定吸光度。另精密吸取蒸馏水1.0 mL，同法操作，作为空白对照。以葡萄糖浓度C（mg/mL）为横坐标，吸光度A 为纵坐标，计算回归方程。

2.2.3 样品溶液多糖含量的测定分别精密吸取3 份浓度为0.1 mg/mL 麦冬粗多糖样品溶液1.0 mL，于10 mL具塞试管中，按2.2.2 项下操作，测定吸光度，计算样品多糖的百分含量。

2.2.4 Sevag 法脱除麦冬多糖中蛋白质[8]Bradford 法测定蛋白质含量。

2.3 麦冬有效部位对支原体感染小鼠脏器指数及肺组织炎症的影响

2.3.1 实验材料100 只BALB/c 小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，SPF 级，许可证号SCXK（京）2012-0001。阿奇霉素分散片（批号：20130502）购于哈药集团制药六厂；养阴清肺糖浆（批号：3150021）购于北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂；麦冬饮片（批号：130109）购于河北安国振宇药业有限公司，经鉴定麦冬为四川麦冬Radix Ophiopogonis（Thunb.）Ker-Gawl.的干燥块根；PPLO 培养基购于Becton，Dickinson and Company，USA；苏木伊红染液购于南京建成公司；防脱片购于哈尔滨博润生物公司；甲醛、甲醇、乙醇、盐酸、二甲苯等均为分析纯。肺炎支原体国际标准菌株（ATCCFH15531）购于美国菌种保藏中心。DL-CJ-1W 生物净化工作台购于北京东连哈尔仪器制造有限公司；Milli-Q Reference system 自动双重纯水蒸馏器购于MILLI-Q公司；BP211D分析天平购于Sartorius公司；2、20、200 μL 微量加样器购于Eppendoff 公司；MDF-382E -80 ℃低温冰箱购于日本三洋公司；KD-TS3A 自动组织脱水机购于浙江金华科迪仪器设备有限公司；KD-BM 生物组织包埋机购于浙江金华科迪仪器设备有限公司；RM2235 组织切片机购于德国莱卡公司；BX4-1 生物显微镜购于OLYMPUS 公司；DP-72 组织生物信号采集分析系统购于OLYMPUS 公司。

2.3.2 动物分组100 只BALB/c 小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，随机分为10 组，每组10 只。分别为空白对照组、模型对照组、阿奇霉素组、养阴清肺组、麦冬多糖高剂量组、麦冬多糖中剂量组、麦冬多糖低剂量组、麦冬皂苷高剂量组、麦冬皂苷中剂量组、麦冬皂苷低剂量组。

2.3.3 造模、给药及标本采集先用乙醚麻醉，然后用微量加样器吸取106 CCU/mL 肺炎支原体培养液缓缓滴入小鼠鼻孔内利用其自然吸气式动作，将菌液吸入气道至肺部。20 μL 感染3 d，3 d 后给药，采取灌胃的方法给药，空白组和模型组给等容积的生理盐水，阿奇霉素组给药5 d（第1 天给65 mg/kg，第2～5 天给32.5 mg/kg）、养阴清肺组（5 mL/kg）、麦冬多糖高剂量组（81.2 mg/kg）、麦冬多糖中剂量组（40.6 mg/kg）、麦冬多糖低剂量组（20.3 mg/kg）、麦冬皂苷高剂量组（66.8 mg/kg）、麦冬皂苷中剂量组（33.4 mg/kg）、麦冬皂苷低剂量组（16.7 mg/kg），连续给药6 d，剥离胸腺和脾脏后立即电子天平称重；剪取左肺组织，放入4%甲醛中固定。

2.3.4 脏器指数影响胸腺指数及脾脏指数计算依据以下公式：胸腺（脾脏）指数（g/100 g）=100×胸腺（脾脏）质量/体质量。

2.3.5 对肺组织病理变化的影响取甲醛固定的肺组织，用乙醇梯度脱水，二甲苯中透明2 次，放入石蜡内进行包埋。蜡块修好后固定于石蜡切片机上切片，将完全展开的蜡片贴附于清洁载玻片上，常规HE染色，显微镜下观察肺组织病理改变。

2.3.6 统计学方法采用 SPSS 17.0 软件进行统计学分析。所有数据用均数±标准差（）表示，2 组间均数比较采用独立样本t检验。

3 实验结果

3.1 麦冬皂苷含量测定结果

3.1.1 标准曲线在最大吸收波长397 nm 处检测吸光度，得标准曲线回归方程Y=7.001 4X＋0.033 7，相关系数R2=0.999 8。表明麦冬总皂苷在25～300 μg范围内含量与吸光度呈良好线性关系。

3.1.2 正交试验结果正交试验结果及分析见表3，4。通过比较可以看出，各因素对麦冬皂苷提取率的影响为A ＞C ＞B，最佳的提取条件为A2B3C2。表4 可以看出A、B 和C 对麦冬皂苷的提取均有显著性影响。由表3 可以看出提取次数的第2 水平和第3 水平的影响基本一样，从节约成本的角度考虑，将提取次数确定为3 次。这样提取的最佳工艺为用75%乙醇提取，提取时间2 h，提取3 次。

表3 提取工艺正交试验结果

表4 提取工艺方差分析结果

3.1.3 动态吸附单因素试验结果结果见图1。单因素试验结果表明，影响麦冬总皂苷含量的提取工艺条件范围可以确定为：静止时间50 min，吸附液量与树脂的最佳比例为6:1，乙醇最佳洗脱浓度为70%，最佳的洗脱剂用量为6 倍树脂体积的量。

3.1.4 麦冬皂苷含量测定分别称取3 份麦冬药材，每份10 g，以皂苷提取的最佳工艺条件进行提取，麦冬皂苷的得率为2.17%，皂苷的含量为59.21%。

3.2 麦冬多糖含量测定结果

3.2.1 葡萄糖标准曲线在最大吸收波长627 nm 处检测吸光度，得回归方程Y=9.905X＋0.007 1，相关系数R2=0.998。表明在0.020～0.10 mg/mL 范围内葡萄糖的含量与吸光度呈良好线性关系。

图1 动态吸附单因素试验结果

3.2.2 麦冬多糖含量测定 见表5。多糖提取率（%）=粗多糖质量/药材质量×100%=11.8%

表5 多糖含量测定结果

3.2.3 Sevage 法脱除麦冬多糖中蛋白质

3.2.4 牛血清蛋白溶液标准曲线 牛血清白蛋白溶液标准曲线回归方程为Y=0.006 2X＋0.182 7，相关系数R2=0.998 5。表明在10～80 μg 范围内，牛血清白蛋白的含量与吸光度呈良好线性关系。

3.2.5 Sevage 法脱除麦冬多糖中蛋白质试验结果 通过氯仿正丁醇体积比为5:1，样品和Sevage 试剂体积比为1:1，脱蛋白2 次后，经蒽酮硫酸法测定除蛋白后的多糖百分含量由62.16%提高到64.38%，证明多糖纯化效果较好。

3.3 脏器指数及病理实验结果

3.3.1 小鼠状态观察 空白组小鼠目光有神，反应灵敏，活泼好动，毛色有光泽，呼吸平稳，进食正常，体质量逐渐增加；模型组小鼠毛色枯槁无光泽、易脱落，目光呆滞，精神萎靡，呼吸急促不畅，鼻周可见脓性分泌物，偶有血丝，舌质暗，肺部出现明显的肺湿呼吸音，进食及活动减少；体质量虽有增加，但低于空白对照组；各给药组症状有所减轻，毛色光泽尚可，有脱落，反应较迅速，精神及活动尚可，食量、饮水较正常，一般状态明显优于模型组。

3.3.2 肺组织形态观察 空白组小鼠肺外观无异常，呈粉红色，表面光滑，弹性好。模型组小鼠肺部病变明显，外观充血、水肿，暗红色，严重者肺叶分布散在大小不等的坏死灶。各给药组与模型组相比较，双肺色泽、硬度、弹性、体积、结节样改变等情况有不同程度的好转，肺脏轻度水肿，但个别鼠仍可见两肺的颜色略暗红，大部分动物肺脏弹性尚可，部分肺叶偶见散在的点状灰白色斑块。

3.3.3 药物对脏器指数的影响 见表6。

表6 对小鼠脾和胸腺指数的影响（，n =10） g/100 g

表6 对小鼠脾和胸腺指数的影响（，n =10） g/100 g

注：与空白组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

与空白对照组比较，模型组的脾脏和胸腺指数明显降低（P＜0.05）。脾脏指数显示，与模型组相比麦冬皂苷中、低剂量组及麦冬多糖低剂量组具有极显著差异（P＜0.01），阿奇霉素组、养阴清肺组及麦冬多糖中剂量组具有显著差异（P＜0.05）；胸腺指数显示，与模型组对比，养阴清肺组，麦冬皂苷中、低剂量组，麦冬多糖中、低剂量组具有极显著差异（P＜0.01），阿奇霉素组及麦冬皂苷高剂量组具有显著差异（P＜0.05）。

3.3.4 HE 染色观察 由肺组织切片可见空白组小鼠肺组织结构清晰正常，无间质性肺炎改变，仅个别偶有淋巴样细胞浸润，模型组小鼠肺组织有明显炎症，炎症反应包括气管支气管周围的炎性细胞浸润，气管支气管腔内的炎性细胞渗出，偶有充血，血管周围的炎性细胞浸润和间质性肺炎，以上均不同程度的存在，说明造模成功。各组病理结果图片见图2。

图2 麦冬有效部位对支原体感染小鼠肺组织病变的影响（HE，×20）

4 讨论

本试验通过对麦冬皂苷提取工艺研究，提取皂苷后的残渣收集，再进行多糖提取工艺的研究，达到对麦冬饮片的综合利用。结果显示，麦冬皂苷的得率为2.17%，皂苷含量为59.21%；麦冬粗多糖百分含量为62.16%，脱蛋白后含量可以达到64.38%，多糖提取率为11.8%。

脾脏和胸腺是人体非常重要的免疫器官，脾指数和胸腺指数的变化直接反映了机体的免疫功能状态。实验结果显示，模型组小鼠的脾脏指数、胸腺指数显著低于空白组（P＜0.05），说明在小鼠感染肺炎支原体肺炎之后免疫指数低下，麦冬多糖及麦冬皂苷可明显增加脾脏、胸腺质量，提升脏器指数，说明麦冬有效部位可提高肺炎支原体肺炎免疫功能。

肺炎支原体肺炎感染小鼠肺组织的主要病理表现为间质性肺炎和细支气管肺炎，通过实验结果可以看出，麦冬多糖及麦冬皂苷能明显减轻肺炎支原体肺炎感染引起的小鼠肺部炎症，可调节肺组织形态结构趋向正常。