白芍总苷对木瓜蛋白酶诱导的膝骨性关节炎模型Rho/Rock信号转导通路的调控作用

王 健

（辽宁中医药大学附属医院骨伤科，沈阳 110032）

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是一种常见的非炎性退行性关节疾病，以关节软骨退化或丢失、软骨下骨硬化、关节边缘骨质增生形成骨赘等为主要的病理特征[1]，以膝关节最为常见，约占所有骨性关节炎的80%以上[2]。资料显示，该病在全世界的标准化发病率为3.8%，我国发病率为3%～15.6%，65 岁以上人群更是高达68%[3-4]。研究认为，白芍总苷在类风湿性关节炎的治疗中有较好疗效[5]，但干预骨性关节炎的相关研究较少。我们从对Rho/Rock 信号通路的影响出发，探讨白芍总苷对去骨性关节炎症的影响。

1 实验材料

8 周龄清洁健康雄性SD 大鼠90 只，平均体质量（245.26±8.93）g，购自中国食品药品检定研究院，动物许可证号：SCXK（粤）2016-0041。饲养环境：温度（21±2）℃，湿度（50±5）%，自由进食普通标准饲料和蒸馏水，定期清扫、更换垫料及消毒。白芍总苷胶囊，批号：20180103，购自宁波立华制药有限公司，采用无菌生理盐水溶解配制成浓度为5、10、20 mg/mL 的白芍总苷溶液；双醋瑞因胶囊，批号：20180215，购自昆明积大制药有限公司；木瓜蛋白酶，CAS 号：9001-73-4，货号：BM0969，购自合肥博美生物科技有限责任公司。大鼠白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒，购自深圳市豪地华拓生物科技有限公司；鼠抗Ras 同源基因A（Rho A）、Rho 相关螺旋卷曲蛋白激酶1（ROCK1）、B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体，购自厦门慧嘉生物科技有限公司。C3000 型离心机，北京托摩根生物科技有限公司产品；FC 型全自动酶标仪、E-Gel Imager 型凝胶成像系统，美国Thermo Fisher Scientific 公司产品；IX73 型荧光显微镜，日本Olympus 公司；DYCZ-20H型电泳仪，购自北京六一生物科技有限公司。

2 实验方法

2.1 造模及给药方法[6]大鼠按随机数字表法分为对照组15 只及造模组75 只，禁食12 h 麻醉，于右后肢膝关节周围1 cm 区域常规备皮、消毒，自右后肢膝关节髌腱外缘进针，至股骨髁后退回2 mm，造模组向关节腔内注射恢复至室温的4%木瓜蛋白酶溶液0.2 mL，对照组向关节腔内注射无菌生理盐水0.2 mL，注射时间为第1 天、第4 天、第7 天。2 周后成功建立骨性关节炎模型。造模成功的大鼠随机分为模型组、白芍总苷低、中、高浓度组及双醋瑞因组，各15 只，模型组及对照组分别灌胃给予无菌生理盐水5 mL/kg，每日1 次；白芍总苷低、中、高浓度组分别灌胃给予5、10、20 mg/mL 白芍总苷溶液5 mL/kg，每日1次；双醋瑞因组灌胃给予2 mg/mL 双醋瑞因溶液5 mL/kg，每日1 次。各组大鼠均连续给药8 周。

2.2 标本采集与处理 腹腔注射10%水合氯醛溶液5 mL/g 麻醉大鼠，屈伸活动大鼠左后肢膝关节，向关节腔内注射生理盐水2 mL 并反复抽吸，离心，取上清液置于-80 ℃冰箱内保存；处死大鼠，采用组织刀片刮取胫骨平台及股骨髁软骨，将胫骨平台软骨置于10%中性甲醛溶液内固定48 h，后常规脱水、石蜡包埋，切片机制备厚度为6 μm 的组织切片，置于4 ℃冰箱内保存。

2.3 TUNEL 法测定大鼠软骨细胞凋亡指数[7]取软骨组织切片参考TUNEL 试剂盒说明书进行操作，测定大鼠软骨细胞凋亡指数。

2.4 ELISA 法检测关节液IL-1β、TNF-α 水平 取关节液上清液，恢复至室温，用全自动酶标仪，严格按照ELISA 检测试剂盒说明书操作，检测关节液IL-1β、TNF-α 水平。

2.5 Western-blot 法检测大鼠关节软骨组织RhoA、Rock1、Bcl-2 表达水平[7]冻存的股骨组织置于液氮内研磨成粉，参考Western-blot 试剂盒说明书进行操作，检测大鼠关节软骨组织RhoA、Rock1、Bcl-2 表达水平。

3 统计学分析

采用SPSS 22.0 软件包分析，符合正态性的计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t 检验。

4 结果

4.1 各组大鼠膝关节肉眼观察结果 对照组关节液透明清亮，无炎症反应，滑膜形态正常，软骨呈明亮的淡蓝色，表明光滑，未见裂纹、软化灶；模型组关节液为黏稠的黄色滤泡样，关节颜色淡黄无光泽，滑膜肥厚且表面凹凸不平，软骨弹性及厚度下降，部分可见裂纹及破溃；白芍总苷低、中浓度组关节液颜色淡黄存在少量滤泡，滑膜肥厚较模型组不同程度减轻，关节稍呈白色，软骨透明度一般但较模型组不同程度好转；骨碎补组、白芍总苷高浓度组及双醋瑞因组关节液接近透明，滑膜未见明显肥厚，关节稍呈白色，光泽度一般，软骨透明度较高，表面无裂纹、破溃。

4.2 各组大鼠软骨细胞凋亡指数（AI）比较 TUNEL

染色结果显示，与模型组比较，白芍总苷低、中、高浓度组及双醋瑞因组大鼠软骨AI 均较低，且白芍总苷低浓度组＞白芍总苷中浓度组＞白芍总苷高浓度组和双醋瑞因组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠软骨AI 比较（，n =15）

表1 各组大鼠软骨AI 比较（，n =15）

注：与模型组比较，# P ＜0.05；与白芍总苷低浓度组比较，△P＜0.05；与白芍总苷中浓度组比较，▲P ＜0.05

4.3 各组大鼠关节液IL-1β、TNF-α 水平比较 与模型组比较，白芍总苷低、中、高浓度组及双醋瑞因组大鼠关节液IL-1β、TNF-α 水平均较低，且白芍总苷低浓度组＞白芍总苷中浓度组＞白芍总苷高浓度组和双醋瑞因组（P＜0.05）。（见表2）。

表2 各组大鼠关节液IL-1β、TNF-α 水平比较（，n =15）

表2 各组大鼠关节液IL-1β、TNF-α 水平比较（，n =15）

注：与模型组比较，# P ＜0.05；与白芍总苷低浓度组比较，△P ＜0.05；与白芍总苷中浓度组比较，▲P ＜0.05

4.4 各组大鼠关节软骨组织RhoA、Rock1、Bcl-2、Bax 表达水平比较 与模型组比较，白芍总苷低、中、高浓度组及双醋瑞因组大鼠关节软骨组织RhoA、Rock1 表达水平较低，且白芍总苷低浓度组＞白芍总苷中浓度组＞白芍总苷高浓度组和双醋瑞因组（P＜0.05）。与模型组比较，白芍总苷低、中、高浓度组及双醋瑞因组大鼠关节软骨组织Bcl-2 表达水平均较高，且白芍总苷低浓度组＜白芍总苷中浓度组＜白芍总苷高浓度组和双醋瑞因组（P＜0.05）（见表3）。

表3 各组大鼠关节软骨组织RhoA、Rock1、Bcl-2 表达水平比较（，n =13）

表3 各组大鼠关节软骨组织RhoA、Rock1、Bcl-2 表达水平比较（，n =13）

注：与模型组比较，# P ＜0.05；与白芍总苷低浓度组比较，△P ＜0.05；与白芍总苷中浓度组比较，▲P ＜0.05

5 讨论

膝骨性关节炎为老年常见的关节骨病，具有经久难愈、易复发等特点，为临床治疗难题之一[8-10]，其发生受到年龄、肥胖、机械等因素的影响，发病机制涉及到金属蛋白酶及其抑制剂表达、炎性细胞因子释放、软骨代谢相关信号通路等多方面变化，尚未完全明确。中医认为，膝骨性关节炎属于“骨痹”“膝痹”“历节病”等范畴[11]，病机为本虚标实之证，本虚是肝肾亏虚、气血不足致经脉失濡，标实为寒湿侵袭、气滞血瘀致经气不通。中医药在此方面有其独特的优势，日益受到医学界关注。在本次研究中，我们即采用中药提取物白芍对膝骨性关节炎大鼠进行干预，以观察其治疗膝骨性关节炎的可能性。

我们采用不同浓度的白芍总苷对去势骨质疏松症大鼠模型进行治疗，白芍总苷具有抗炎症反应、清除氧自由基、神经保护、抗肿瘤、镇痛、抗凝、抗心肌重构、等药理作用，在心血管系统、神经系统、消化系统、皮肤及骨骼系统等多种疾病中均有较好的干预效果[12-13]。王欢等[14]研究结果发现，白芍总苷能通过调节人膝关节骨性关节炎滑膜成纤维细胞生长、增殖来影响骨性关节炎发展过程；我们采用木瓜蛋白酶关节腔注射法诱导膝骨性关节炎，软骨的退行性改变和破坏是膝骨性关节炎的基础病理变化，软骨细胞凋亡增加，打破了软骨正常代谢平衡，可引起软骨退变消失，若伴有细胞外基质降解，则最终引发骨性关节炎[15]。软骨细胞凋亡率与骨性关节炎软骨损伤程度密切相关。TUNEL 细胞凋亡检测结果显示高浓度白芍总苷可以有效抑制关节软骨细胞凋亡，发挥软骨保护作用。

研究表明，膝骨性关节炎的发生发展与炎性反应有关，发病过程中有IL-1β、TNF-α 等多种炎性因子参与其发病过程[16]，这些炎性因子由单核细胞、软骨细胞等释放，不仅可以介导炎症反应，引发局部症状，还能通过激活Rho/Rock 等相关信号通路诱导软骨细胞凋亡，加速软骨退化和病情进展。RhoA 和Rock1 是Rho/Rock 信号通路中的关键信号分子，RhoA 属于鸟苷三磷酸（GTP）酶家族一员，在信号通路中扮演分子开关的角色，能够被IL-1β、TNF-α 等炎性因子激活，进而激活下游靶分子Rho 激酶，发挥生物学效应；Rock1 为Rho 激酶的一种，被激活后可参与软骨细胞增殖、细胞骨架重建、基因表达等过程的调节。Rho/Rock 信号通路表达强化可能加速软骨损伤及退行性病变进展，诱发骨性关节炎。Bcl-2 是Rho/Rock 信号通路下游的信号分子，具有抗细胞凋亡的作用，当Rho/Rock 信号通路活性被抑制时，Bcl-2 表达水平上调，从而发挥细胞保护作用。