近红外光谱技术对香附及其炮制品醇溶性浸出物的快速测定

乔 璐，吕 芳，王若晨，董诚明*，张园园，牛晓雅，张 娟

（1. 河南中医药大学 药学院， 河南 郑州 450046； 2. 河南中医药大学 针灸推拿学院， 河南 郑州 450046）

香附为莎草科植物莎草Cyperus rotundus L.的干燥根茎[1]，具有疏肝解郁、调经止痛之功效，用于治疗肝郁气滞、胸肋胀痛、疝气疼痛等症。中药炮制的目的在于改变药物的性能和功效，因炮制方法不同其功效有所差别，香附的炮制品主要有醋香附、酒香附、炙香附和四制香附等， 2020 版《中国药典》中对香附及其炮制品的检验标准较少，质量标准不统一，鉴别存在困难。近红外光谱技术作为一种快速无损的分析方法[2-5]，为中药材质量评价和鉴别提供了新的途径。本实验将近红外技术与化学计量相结合，建立了香附及其炮制品的醇溶性浸出物含量快速检测及各炮制品的特征波段筛选，为香附及其炮制品的质量评价提供依据。

1 材料和方法

1.1 药材与试剂

60 批香附药材采购于河南、山东、浙江、广东、山西、河北、安徽、亳州和海南等9 地区，经河南中医药大学药学院董诚明教授鉴定，每批药材分为4份用于炮制。药材及其炮制品粉碎后过5 号标准筛。医用乙醇（95%，新乡市三伟消毒制剂有限公司）。

1.2 仪器

FA2004N 型电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；Antaris II 型傅立叶变换近红外光谱仪（ThermoFisher Scientific 公司）；SUS304 型高速粉碎机；TQ Analyst9.0 软件处理光谱。

2 方法与结果

2.1 炮制样品的制备

醋香附：称取约100 g 生香附，加20 g 米醋拌匀，润透，用文火炒干；酒香附：称取约100 g 生香附，加20 g 黄酒拌匀，润透，用文火炒干；四制香附：称取约100 g 生香附，加5 g 生姜汁、10 g 米醋、10 g 黄酒、食盐水（食盐2 g，清水溶化）拌匀，润透，用文火炒干[6]。

2.2 醇溶性浸出物测定方法

精密称定供试品约3.8 g，置250 mL 锥形瓶中，精密加稀乙醇（50%左右，由95%乙醇配制）约100 mL，密塞，称定重量，静置1 h，时时振摇，连接冷凝回流管，加热至微沸，并保持微沸1 h。放冷后，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用稀乙醇补足失重，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量[1]。测得香附及炮制品的醇溶性浸出物的测量含量分别为生香附：15.64% ～ 26.16%，醋香附：15.02% ～26.15%， 酒 香 附15.32% ～ 25.80%， 四 制 香 附：15.35% ～ 27.46%，醇浸出物均达到2020 版《中国药典》规定。由实验结果得到四制香附的浸出物含量最高，较生香附提高4.5%，醋香附、酒香附含量变化较小。

2.3 光谱采集

对香附其及炮制品共计240 个样品进行光谱采集，样品采样的方式为旋转采样，光谱范围为12 000 ～4 000 cm-1。背景光谱扫描32次，每个样品扫描64次，扫描时间平均为60 s，实验所得样品光谱为直接去除背景的光谱，见图1。

图1 香附原始近红外光谱Fig. 1 Original near infrared spectrum of Cyperus rotundus L.

2.4 建立模型

2.4.1 光谱预处理 需对香附药材的近红外原始光谱预处理，提高模型的性能。常用的预处理方法有一阶导数（First Derivative, FD）、二阶导数（Second Derivative, SD）、多元散射校正（Multiplicative signal correction，MSC）、标准正态变量变换（Standard normal varidte transformation，SNV）、矢量归一化、最大－最小归一化等[7-8]。

本实验采用偏最小二乘法（Partial least squares，PLS）为建模方法，以校正集均方差（Root Mean Square Error of Calibration , RMSEC）、验证集均方差（Root Mean Square Error of Prediction, RMSEP）、校正集相关系数、验证集相关系数及相关系数（R2）作为最佳光谱预处理的评价指标。

在满足RMSEP/RMSEC ≤1.2 的条件下，所建光谱RMSEC 越小，表明校正模型建立越合理；RMSEP 越小，表预明模型的测性能越好；R2越接近于1，表明模型的预测准确性越高[7-8]。生、醋、酒、四制香附醇溶性浸出物含量的近红外光谱预处理方法效果最好的依次为SNV ＋FD、MSC ＋原始光谱、原始光谱和原始光谱。其分析方法见表1。

表1 光谱预处理Tab. 1 Spectral pretreatment

2.4.2 波段选择 不同波段建立的模型预测性不同，建模波段的范围过长，将包括大量的多余信息，降低了模型的预测准确性；波段范围过短，缺乏代表性，也影响模型的适用性和预 测 性[4]。 本 实 验 根 据R2、RMSEC、RMSEP及RMSEP/RMSEC 为综合指标选取最佳波段结果见表2。生、醋、酒、四制香附浸出物含量的最 佳 建 模 波 段 依 次 为4 046.76 ～ 5 079.58 cm-1、

4 042.63 ～ 4 959.74 cm-1、4 238.77 ～ 4 867.73 cm-1、4 000.00 ～ 5 400.00 cm-1。

2.4.3 主因子数的选择 PLS 建立定量模型时，主因子数的不同，导致模型预测结果差异也不同。主因子数过多，导致“过度拟合”现象，主因子数过少，模型预测能力较差[7]。以内部交叉验证均方差（Cross-validation Mean Square Error, RMSECV） 为指标，考察主因子数对浸出物含量的影响。当生、醋、酒、四制香附样品的主因子数分别为7、10、10、10时，模型的RMSECV 值最低，模型预测精确度较高。

表2 香附及其炮制品浸出物不同光谱范围的影响Tab. 2 Effects of different spectral ranges of the extracts from Cyperus rotundus L. and its processed products

2.4.4 校正集与验证集样品的选择 随机选取52 个生香附、51 个醋香附、49 个酒香附、50 个四制香附样品校正集见表3，含量范围分别为15.64% ～26.16%、15.02% ～ 26.15%、15.32% ～ 25.80%、15.35% ～ 27.46%，剩余样品作为验证集。验证集的范围均在校正集范围之内，具有可验证性。

表3 校正集与验证集Tab. 3 Calibration and validation

2.4.5 定量模型的建立 通过PLS 法建模对香附浸出物含量建立定量模型。药材样品中生、醋、酒、四制香附所建模型分别为R2＝0.980 2，RMSEC ＝0.005 38； R2＝0.969 8，RMSEC＝0.006 54；R2＝0.958 9，RMSEC ＝0.007 34；R2＝0.964 2，RMSEC ＝0.008 70；验证集相关系数为R2＝0.966 8、 R2＝0.977 9、 R2＝0.983 2、R2＝ 0.965 0，RMSEP ＝0.005 21、RMSEP ＝0.004 77、RMSEP ＝0.004 58、RMSEP ＝ 0.007 53。实测值与参考值的相关图见图 2，偏差图见图 3。由图可知，检验样本集中在趋势线y ＝x 附近，该模型精度高，均方根误差小。

2.4.6 模型的验证 根据香附药材样品及相关评价性参数建立的模型，对验证集进行验证，结果见表4。从表可知，在建立醇溶液浸出物的近红外模型中，生、醋、酒、四制香附样品外部验证集的实测值与参考值绝对误差最大值分别为0.95%、1.01%、0.98%、1.11%，相对误差最大值分别为4.76%、4.64%、4.77%、5.94%，平均相对误差分别为2.27%、2.14%、1.94%、3.07%。所建模型的预测性准确。

图2 实测值与预测值Fig. 2 Measured values and calculated values

图3 实测值与预测值的偏差图Fig. 3 Deviation between the measured value and the reference value

表4 验证集醇溶液浸出物参数比较Tab. 4 Verifies the comparison of the parameters of the extract with alcohol

3 讨论

本实验根据2020 版《中国药典》标准利用传统热浸法与近红外光谱法相结合的方式，采用TQ 9.0 建立了近红外快速测定中药材香附及其炮制品（醋、酒、四制香附）中的醇溶液浸出物含量模型，其中生香附：15.64% ～ 26.16%，醋香附：15.02% ～26.15%，酒香附：15.32% ～ 25.80%，四制香附：15.35% ～ 27.46%，醇浸出物均达到2020 版《中国药典》规定。以生香附为对照，对比醋、酒、四制浸出物的含量，发现四制较生香附提高4.5%，根据综合指标参数选择生、醋、酒、四制香附最佳预测波段依次为4 046.76 ～ 5 079.58 cm-1、4 042.63 ～ 4 959.74 cm-1、4 238.77 ～ 4 867.73 cm-1、4 000.00 ～5 400.00 cm-1。其中在4 800.00 ～ 5 300.00 cm-1的吸收峰存在较大差异，这也是香附炮制品的特征波段。利用PLS 方法建立香附药材醇浸出物的近红外定量校正模型。其中R2分别为0.958 9、0.942 8、0.929 2、0.929 6，RMSEC 为0.005 38、0.006 54、0.007 34、0.008 70；RMSEP 为0.005 21、0.004 77、0.004 58、0.007 53。生、醋、酒、四制香附样品外部验证集的实测值与参考值绝对误差最大值分别为0.95%、1.01%、0.98%、1.11%，相对误差最大值分别为4.76%、4.64%、4.77%、5.94%，平均相对误差分别为2.27%、2.14%、1.94%、3.07%，说明所建近红外定量分析模型较准确。

4 结论

本实验将近红外技术与化学计量相结合，建立了香附及其炮制品醋香附、四制香附、酒香附的醇溶性浸出物含量快速检测及各炮制品的特征波段提取筛选方法，为建立香附不同炮制品的质量标准提供数据支撑。