利多卡因上调MDC1-AS对膀胱癌细胞T24凋亡、迁移侵袭的影响Δ

丁志刚

(首都医科大学附属北京世纪坛医院麻醉科，北京 100038)

膀胱癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤之一。经尿道切除和膀胱内化疗联合治疗是非肌肉浸润性膀胱癌的重要治疗策略，但大多数患者仍会复发，最终约20%的复发肿瘤侵袭局部肌肉或转移[1]。膀胱癌的难治性与其浸润特性有关。回顾性研究结果显示，局部麻醉在预防肿瘤转移和复发中发挥了重要作用[2]。利多卡因是临床常用的麻醉药，常用于治疗心律失常和缓解急性或慢性疼痛。近年来，多项研究结果指出，利多卡因通过抑制癌细胞生长和转移、诱导细胞凋亡，在乳腺癌、胃癌等人类恶性肿瘤中显示出抗肿瘤潜力[3-4]。利多卡因通过增加宫颈癌细胞中长链非编码RNA(lncRNA)MEG3表达水平，调节宫颈癌细胞活力和凋亡，进而抑制宫颈癌细胞生长[5]。有文献报道，利多卡因以浓度依赖的方式抑制膀胱癌细胞增殖，利多卡因和丝裂霉素C的联合应用可以延长荷瘤小鼠的生存期[6]。然而，利多卡因对膀胱癌细胞凋亡、迁移前侵袭的影响和机制仍未阐明。lncRNA DNA损伤检测点介质1反义RNA(MDC1-AS)是近年来发现的膀胱癌抑癌lncRNA，研究结果指出，恢复膀胱癌中MDC1-AS表达水平，可显著降低膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力[7]。本研究通过分析利多卡因对膀胱癌细胞T24凋亡、迁移和侵袭以及对MDC1-AS表达的影响，探讨其抗肿瘤作用是否与调控MDC1-AS表达有关，以期为利多卡因在膀胱癌治疗中的应用提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

7500型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；CytoFLEX型流式细胞仪(美国BECKMAN公司)。

1.2 药品与试剂

盐酸利多卡因注射液(山西晋新双鹤药业,批准文号为国药准字H11022295，规格为10 ml∶0.2 g，批号为20151102)；MDC1-AS过表达质粒(pcDNA-MDC1-AS)及其对照(pcDNA)、MDC1-AS小干扰RNA(si-MDC1-AS)及其对照(si-NC)购自广州锐博生物；膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)试剂盒购于北京全式金生物；Transwell小室和基质胶购自美国康宁公司；兔源B细胞淋巴瘤(Bcl-2)和Bcl相关x蛋白(Bax)、磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体以及羊抗兔IgG二抗购自上海赛信通公司；逆转录试剂盒、SYBR Green PCR Master Mix购于北京天根生化公司。

1.3 实验细胞

膀胱癌细胞T24购于美国ATCC公司。

2 方法

2.1 细胞培养、转染和分组

T24细胞在37 ℃、CO2体积分数为5%的湿润培养箱中用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的杜尔伯格伊戈尔培养基(DMEM)培养。采用含1.25、2.5及5 mg/ml利多卡因[6]的培养液孵育T24细胞2 h，分别命名为利多卡因1.25 mg/ml组、利多卡因2.5 mg/ml组以及利多卡因5 mg/ml组，以正常培养的T24细胞作为对照。参照下述实验方法检测细胞凋亡、迁移、侵袭以及MDC1-AS表达：为探讨利多卡因是否通过调控MDC1-AS表达进而影响T24细胞凋亡、迁移和侵袭，采用脂质体转染试剂Lipofectamine 2 000分别转染pcDNA、pcDNA-MDC1-AS、si-NC及si-MDC1-AS至对数期T24细胞；转染pcDNA、pcDNA-MDC1-AS细胞分别记为pcDNA组、pcDNA-MDC1-AS组；用含5 mg/ml利多卡因的培养液孵育转染si-NC、si-MDC1-AS的T24细胞2 h，分别记为利多卡因5 mg/ml+si-NC组、利多卡因5 mg/ml+si-MDC1-AS组。

2.2 流式细胞术分析细胞凋亡

将各组细胞重悬于结合缓冲液100 μl中，分别添加Annexin V-FITC 10 μl、PI 5 μl，在室温(25 ℃)下于黑暗环境中孵育30 min后，补加结合缓冲液400 μl。采用流式细胞仪分析细胞凋亡(Annexin-V染色阳性)情况。

2.3 Transwell实验分析细胞迁移和侵袭

向24孔板下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培养基500 μl，向未涂抹(迁移)或涂抹(侵袭)Transwell上腔室中加入无血清培养基稀释的单细胞悬液200 μl(细胞数约为1×105个)。培养24 h后，以棉签去除Transwell上腔室膜表面细胞，用4%多聚甲醛固定下室膜表面细胞。结晶紫染色后显微镜下观察细胞过膜情况，以5个随机视野的细胞数均值表示细胞迁移或侵袭能力。

2.4 免疫印迹法(Western blot)分析Bcl-2和Bax蛋白表达

RIPA裂解缓冲液裂解细胞。离心去除细胞碎片，并用BCA法分析蛋白浓度。聚丙烯酰胺凝胶电泳将等量蛋白分离，并用转膜装置将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上。室温下，按照5%脱脂牛奶孵育1 h，第一抗体(1∶ 1 000稀释)孵育2 h，第二抗体(1∶ 2 000稀释)孵育1 h进行免疫印记。电化学发光法显色后，通过Quantity One软件分析各条带灰度值，目的蛋白表达水平以对应蛋白和内参GAPDH灰度值表示。

2.5 实时定量反转录聚合酶链反应(reverse transcription q quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)检测MDC1-AS表达量

TRIzol试剂分析细胞中总RNA。逆转录试剂盒将2 μg的RNA反转录为cDNA，再用SYBR Green PCR Master Mix进行RT-qPCR。MDC1-AS表达量采用2-ΔΔCT法计算。MDC1-AS上游引物5′-TCCCAGATGTGCCAAAGTCAG-3′，下游引物5′-AGCAACCCCAGTTGTCATT C-3′；GAPDH上游引物5′-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3′，下游引物5′-GGGGTCATTG ATGGCAACAATA-3′。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 利多卡因对T24凋亡的影响

与对照组比较，2.5、5 mg/ml的利多卡因干预后T24细胞凋亡率、Bax蛋白表达显著升高，Bcl-2蛋白表达量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；不同剂量利多卡因组T24细胞凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白表达量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

表1 利多卡因诱导T24凋亡及对蛋白表达的影响Tab 1 Apoptosis of T24 induced by lidocaine and its effect on protein expression

图1 利多卡因诱导T24凋亡及对蛋白表达的影响Fig 1 Apoptosis of T24 induced by lidocaine and its effect on protein expression

3.2 利多卡因对T24迁移侵袭的影响

与对照组比较，2.5、5 mg/ml的利多卡因干预后T24细胞迁移和侵袭细胞数显著减少，差异均有统计学意义(P<0.05)；不同剂量利多卡因组T24细胞迁移和侵袭细胞数比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2、图2。

图2 利多卡因抑制T24迁移、侵袭图Fig 2 Inhibitors of T24 migration and invasion by lidocaine

表2 T24细胞迁移和侵袭细胞数个，n=3)Tab 2 Number of T24 cell migration and invasion

3.3 利多卡因对T24中MDC1-AS表达的影响

与对照组比较，2.5、5 mg/ml的利多卡因干预后T24细胞中MDC1-AS表达量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；不同剂量利多卡因组T24细胞MDC1-AS表达量比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 利多卡因促进MDC1-AS的表达Tab 3 Promotion of expression of MDC1-AS by lidocaine

3.4 过表达MDC1-AS对T24凋亡、迁移和侵袭的影响

与pcDNA组比较，pcDNA-MDC1-AS组T24细胞中MDC1-AS表达量显著升高，细胞凋亡率、Bax蛋白表达量显著升高，迁移和侵袭细胞数、Bcl-2蛋白表达量显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4、图3。

表4 过表达MDC1-AS诱导T24凋亡、迁移和侵袭Tab 4 Apoptosis, migration and invasion of T24 induced by over-expression of n=3)

3.5 干扰MDC1-AS对利多卡因处理的T24凋亡、迁移和侵袭的影响

与利多卡因5 mg/ml+si-NC组比较，利多卡因5 mg/ml+si-MDC1-AS组T24细胞中MDC1-AS表达量显著降低，细胞凋亡率、Bax蛋白表达量显著降低，迁移和侵袭细胞数、Bcl-2蛋白表达量显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表5、图4。

A.过表达MDC1-AS对T24凋亡的影响；B.过表达MDC1-AS对T24迁移的影响；C.过表达MDC1-AS对T24侵袭的影响A.effect of MDC1-AS overexpression on the apoptosis of T24；B.effect of MDC1-AS overexpression on the migration of T24；C.effect of MDC1-AS overexpression on the invasion of T24图3 过表达MDC1-AS诱导T24凋亡、迁移和侵袭及对凋亡蛋白表达的影响Fig 3 Apoptosis, migration and invasion of T24 induced by over-expression of MDC1-AS and its effect on expression of apoptotic protein

表5 干扰MDC1-AS减弱利多卡因处理的T24凋亡、迁移和侵袭的作用Tab 5 Attenuation of role of interference with MDC1-AS on migration, invasion and expression of apoptotic proteins of T24 cells induced by lidocaine n=3)

A.干扰MDC1-AS减弱利多卡因处理对T24凋亡的影响；B.干扰MDC1-AS减弱利多卡因处理对T24迁移的影响；C.干扰MDC1-AS减弱利多卡因处理对T24侵袭的影响A.interfering with MDC1-AS attenuates the effect of lidocaine treatment on T24 apoptosis；B.interfering with MDC1-AS attenuates the effect of lidocaine treatment on T24 migration；C.interfering with MDC1-AS attenuates the effect of lidocaine treatment on T24 invasion图4 干扰MDC1-AS减弱利多卡因处理的T24凋亡、迁移和侵袭及凋亡蛋白表达的影响Fig 4 Attenuation of effect of interference with MDC1-AS on migration, invasion and expression of apoptotic proteins of T24 cells induced by lidocaine

4 讨论

近年来，多项研究结果指出，利多卡因可抑制多种恶性肿瘤细胞的恶性生物学行为，进而降低肿瘤切除术后肿瘤转移复发的可能性[8-9]。利多卡因可通过诱导细胞周期阻滞降低肺癌细胞增殖能力[10]；通过下调瞬时受体电位阳离子通道亚家族V成员6(TRPV6)表达抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭[11]。在胃癌中，利多卡因对恶性肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用与上调miR-145表达有关[12]。与上述抗肿瘤作用一致，本研究结果显示，利多卡因(2.5、5 mg/ml)可显著抑制膀胱癌细胞T24的迁移和侵袭能力，增加细胞凋亡率，并呈剂量依赖效应。Bax和Bcl-2是线粒体调控途径中的重要基因，Bax是细胞凋亡的启动子，当Bax表达过量时Bax同型二聚体大量形成促进细胞凋亡。研究结果指出，lncRNA通过下调Bax表达、上调Bcl-2表达可抑制膀胱癌细胞凋亡[13]。利多卡因通过增加Bax蛋白、下调Bcl-2表达诱导肝癌细胞凋亡[14]。与上述发现一致，本研究中，利多卡因可显著下调T24细胞中Bcl-2表达、上调Bax表达，表明利多卡因可能通过调控线粒体途径对T24细胞发挥促凋亡作用。上述研究结果表明，利多卡因通过抑制T24细胞迁移和侵袭，增加细胞凋亡，在膀胱癌中具有抗肿瘤作用。

lncRNA是一类蛋白编码能力有限或缺失的RNA转录本，其通过转录后调节或染色质修饰等多种途径调控基因表达在肿瘤发生中发挥作用。MDC1是DNA损伤机制的关键组成部分，参与细胞对DNA损伤的早期反应以保护基因组完整性。MDC1-AS是MDC1的反义lncRNA，研究结果指出，胶质瘤组织中MDC1-AS表达水平较正常脑组织显著下调，且胶质瘤细胞中MDC1-AS也呈低表达，上调MDC1-AS表达可显著抑制胶质瘤细胞增殖和周期进展[15]。此外，MDC1-AS过表达通过MDC1依赖机制抑制人胃癌细胞的增殖和转移[16]。本研究探讨了MDC1-AS在膀胱癌中的作用，发现过表达MDC1-AS可显著上调Bax表达，下调Bcl-2，抑制T24细胞迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。既往研究结果显示，在宫颈癌[5]、肝癌[17]、肺癌[18]、胃癌[19]以及视网膜内皮细胞瘤[20]中，利多卡因的抗肿瘤作用多与调控lncRNA、miRNA表达有关，但利多卡因是否通过调控MDC1-AS表达而影响T24细胞迁移、侵袭和凋亡并未可知。本研究中，经利多卡因(2.5、5 mg/ml)处理后，T24细胞中MDC1-AS表达量以剂量依赖方式增加；而转染si-MDC1-AS干扰MDC1-AS表达显著减弱利多卡因(5 mg/ml)处理对T24细胞的抗迁移、抗侵袭和促凋亡作用，恢复T24细胞迁移、侵袭能力和凋亡水平，这说明上调MDC1-AS表达是利多卡因在膀胱癌中发挥抗肿瘤作用的重要机制。然而，本研究仍存在不足之处，是否存在其他lncRNA参与利多卡因对膀胱癌细胞生物学行为的调控值得探讨；此外，MDC1-AS的下游靶miRNA需进一步确认。

综上所述，本研究证实了利多卡因可抑制膀胱癌细胞迁移、迁移，诱导细胞凋亡，其机制与上调MDC1-AS表达有关，初步揭示了利多卡因在膀胱癌中的抗肿瘤机制，为利多卡因在膀胱癌治疗中的应用奠定了理论基础。