基于网络药理学探讨北豆根-白附子配伍治疗非小细胞肺癌的作用机制Δ

孙长河，杨国旺

(1.北京中医药大学研究生院，北京 100029； 2.首都医科大学附属北京中医医院肿瘤科，北京 100010)

肺癌是目前我国及全世界范围内发病率及死亡率最高的恶性肿瘤[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者约占所有原发性肺癌患者的80%～85%，吸烟与被动吸烟、室内污染、室内氡暴露、室外空气污染、职业因素、肺癌家族史和遗传易感性等均为其危险因素[2]。

NSCLC属中医学“肺积”“肺萎”及“息贲”等范畴，相关学术理论较多，《黄帝内经》中“正气存内，邪不可干”指出肺癌发病正虚为本，“温气不行，凝血蕴里而不散，津液涩渗，著而不去，而积皆成矣”指出瘀血为其病因；朱丹溪在《丹溪心法》中提出“凡人身上、中、下有块者，多是痰”；尤在泾在《金匮要略心典》中提出“痞坚之处，必有伏阳”，张泽生、周仲英等医家提倡癌毒学说，亦有医家提出“阴阳气不相顺接”是肿瘤的病机基础。中药治疗多以扶正、理气、化痰、活血、解毒和清热散节等治法组合应用[3-4]。

北豆根(Menispermi Rhizoma)为防己科植物蝙蝠葛的干燥根茎，味苦，性寒，有小毒，归肺、胃、大肠经，具有清热解毒、祛风止痛的功能，用于咽喉肿痛、热毒泻痢及风湿痹痛的治疗[5]。文献报道，北豆根的成分存在抗肿瘤作用[6-7]。白附子(Typhonii Rhizoma)为天南星科植物独角莲的干燥块茎，味辛，性温，有毒，归胃、肝经，具有祛风痰、定惊搐、解毒散结、止痛的功能，用于中风痰壅、口眼斜、语言謇涩、惊风癫痫、破伤风、痰厥头痛、偏正头痛、瘰疬痰核及毒蛇咬伤[5]。文献报道，白附子的提取物存在抗肿瘤活性[8]。

网络药理学研究是基于大数据技术，以多成分、多靶标、多通路的研究方式，与中药及中药处方中配伍所达到的系统的整体观、辨证论治特点相匹配，是研究中药复方化学成分的相互作用机制的适宜方法[9-11]。本研究在分析杨国旺教授治疗的肺癌病例时发现，应用北豆根-白附子配伍的患者的生存期较长。本研究采用网络药理学研究的方式，探讨北豆根-白附子配伍抗NSCLC的潜在作用机制。

1 资料与方法

1.1 活性成分筛选

药物化学成分筛选：利用中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索“北豆根”“白附子”，得到其所有成分化合物，按口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18筛选，记录筛选后的潜在有效化合物的Pubchem CID或SID及结构(structure)。

1.2 化合物靶点预测

记录“1.1”项中获取有Pubchem CID/SID的化合物，导入Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取其结构简式，将其导入和Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)进行靶点预测。同时，记录“1.1”项中无Pubchem CID/SID及Swiss Target Prediction无法预测靶点的化合物的结构，基于ChEMBL数据库(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)获取化合物的结构式，导入PharmMapper平台(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)预测靶点信息。为全面分析预测北豆根-白附子的化合物，在2种方式预测的靶点中各取可能性居前50位的靶点合并。

1.3 疾病靶点预测

利用人类孟德尔遗传综合数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM)(https://omim.org/)数据库检索“NSCLC”，获取NSCLC相关的前50位基因，作为疾病相关的核心基因。运用Cytoscape 3.6.1软件。导入HYRD数据库(http://www.hprd.org/)人类蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein Interaction，PPI)数据作为背景网络，筛选与NSCLC直接相关的基因蛋白，并取其直接相关的蛋白，作为疾病的相关靶点。

1.4 网络图的构建与分析

根据预测的北豆根-白附子潜在有效化合物、相应的靶点基因，使用Cytoscape 3.6.1软件建立“药物-成分化合物-靶点-疾病”网络，以药物、成分化合物、靶点及疾病为节点，节点之间连线表示两个节点相互存在联系。

1.5 构建PPI网络

将北豆根、白附子成分化合物的靶蛋白与疾病相关靶点匹配，获得药物成分化合物在疾病相关蛋白上的靶点，导入STRING数据库(https://string-db.org/)，设置置信度为0.9，隐藏独立的点，构建PPI网络。

1.6 化合物在人类靶点的功能和通路富集分析

由于NSCLC是一种全身性的综合性的疾病，NSCLC病因与影响因素复杂，使得中药复方在抗肿瘤的机制方面必然不是单一路径。为全面分析北豆根-白附子配伍在防治NSCLC方面的作用，使用R 4.0.2软件，运行“clusterProfiler”包，取P<0.05，将各成分化合物前50位靶点进行基因本体(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。

2 结果

2.1 北豆根、白附子有效成分筛选结果

按照“1.1”对北豆根基白附子的潜在有效成分筛选，表1显示，北豆根通过筛选获得10种潜在有效成分，分别为左旋千金藤啶碱(l-SPD)、苦参碱(matrine)、dauricumine、碎叶紫堇碱(cheilanthifoline)、去羟尖防已碱(acutuminine)、蝙蝠葛辛碱(bianfugecine)、山豆根波芬诺灵碱(dauriporphinoline)、千金藤林碱(stepharine)、青藤碱(sinomenine)及dauricline；白附子通过筛选获得3种潜在有效成分，分别为亚油酸乙酯(mandenol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)及谷甾醇(sitosterol)。

表1 北豆根、白附子中筛选的潜在有效成分及其PubChem主要信息Tab 1 Potential active components and its PubChem information in menispermi rhizoma and typhonii rhizoma

2.2 化合物靶点预测结果

按“1.2”项下方法进行检索，共11种化合物获得了相应的结构简式，导入Swiss Target Prediction平台，获得预测靶点；其余2种化合物于ChEMBL数据库检索获取相应的结构式，导入PharmMapper平台预测靶点信息。对于两处获得的靶点，每种化合物取可能性最高的前50个蛋白靶点合并，共获得668个靶点。

2.3 疾病靶点预测结果

通过OMIM数据库检索NSCLC词条，将获取的前50个基因纳入HYRD数据库的PPI网络，共获取了1 167个相关蛋白靶点。表明NSCLC相关病因及影响因素众多，相关机制复杂。

2.4 网络图构建与分析结果

使用Cytoscape 3.6.1软件，将“2.3”项中PPI网络作为背景网络，筛选其中与药物化合物的共同靶点，共获得101个共同靶点，构建“药物-成分化合物-靶点-疾病”网络，见图1。可见，共有12个化合物存在疾病相关基因的靶点，其中dauriporphinoline的靶点数最多，为18个。

图1 药物-成分化合物-靶点-疾病网络Fig 1 Drug-component-target-disease network

2.5 PPI网络构建结果

将药物与疾病共同靶点导入STRING平台(11.0 Version)(confidence取0.9，隐藏独立的节点)，共获得92个节点，获得所示PPI网络，见图2。

图2 “药物-疾病靶点”的PPI网络Fig 2 PPI network of “drug-disease target”

2.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析

2.6.1 GO功能富集分析：使用R 4.0.2软件，将数据提交至Bioconductor数据库，取P<0.05，对预测获得的所有药物靶基因进行GO分析，并按照参与该功能基因的数量和显著性(P值)进行排序，共查询到276条目，GO活性前30条结果见图3，GO数目前30条结果见图4。其中，富集到活性最高的是蛋白酪氨酸激酶活性(protein tyrosine kinase activity)，主要涉及ALK、ERBB2及EGFR等54个基因；富集到基因数量最多的是丝氨酸/苏氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)，主要涉及GSK3B、EGFR及SYK等89个基因。以上2种GO均与细胞生长、增殖和分化相关。

图3 北豆根-白附子预测靶点GO功能富集分析活性Fig 3 GO function analysis of prediction target of menispermi rhizoma and typhonii rhizoma

图4 北豆根-白附子预测靶点GO功能富集数目Fig 4 Number of GO function analysis of prediction target of menispermi rhizoma and typhonii rhizoma

2.6.2 KEGG通路富集分析：使用R 4.0.2软件，将数据提交至Bioconductor数据库进行KEGG通路富集分析，并按照参与该功能基因的数量和显著性(P值)进行排序，结果见图5。其中NSCLC关键通路有26个基因参与，分别是STAT3、ALK、JAK3、PRKCA、BRAF、AKT1、MAPK1、MAP2K1、PIK3CA、ERBB2、EGFR、BAD、MET、PIK3CD、CDK4、TP53、PIK3CB、PIK3R1、RAF1、RXRA、PDPK1、MAPK3、PRKCG、PRKCB、RARB及RXRG。靶点基因在该通路上的覆盖情况见图6。其中，P53、RXR受体以及PI3K的可能性最高，P53基因的表达激活P53信号通路癌细胞凋亡；RAR、RXR受体参与了包括细胞生长、分化、代谢和胚胎发育等许多重要生理过程的调节，在NSCLC细胞中表达失调[12]；RAF靶点通过MAPK信号通路调控细胞增殖；PI3K通过磷酸化PIP2产生PIP3激活Akt，PI3-Akt信号通路调控细胞凋亡[13-14]。

图5 北豆根-白附子预测靶点KEGG通路富集分析Fig 5 KEGG pathway analysis of prediction target of menispermi rhizoma and typhonii rhizoma

图6 NSCLC通路图及北豆根-白附子靶基因Fig 6 NSCLC pathway map and target gene of menispermi rhizoma-typhonii rhizoma

除目标NSCLC通路外，亦观察到北豆根-白附子参与多条关键通路与NSCLC相关，如细胞凋亡(Apoptosis)、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、ErbB信号通路(ErbB signaling pathway)、血管内皮生长因子信号通路(VEGF signaling pathway)、PD-L1在肿瘤中的表达与PD-1检查点通路(PD-L1 expression and PD-1 checkpoint pathway in cancer)、癌症中的蛋白多糖(Proteoglycans in cancer)以及癌症的中心碳代谢(Central carbon metabolism in cancer)等。

3 讨论

本研究通过网络药理学方法初步探讨了北豆根-白附子配伍治疗NSCLC的分子机制。NSCLC的发生发展是复杂的过程，涉及多系统、多种基因及蛋白机制的病理改变。北豆根-白附子配伍在治疗NSCLC的机制方面表现为多种成分-多通路-多靶点的特点，通过网络药理学方式研究预测的13种化合物，通过单独或共同靶点作用于人体，其中12种化合物作用于NSCLC相关靶点。既往研究结果发现，苦参碱可上调肺癌A549细胞中自噬的特异性标志物LC3-Ⅱ蛋白表达水平，诱导A549细胞自噬[15-16]。青藤碱可抑制肺癌 HCC827、H460和H1975细胞增殖，同时可观察到增殖标志物磷酸化组蛋白H3 S10(p-H3 Ser10)表达的下调[17]；并可通过抑制miR-21的表达从而上调TIMP-1、TIMP-2和反转录富含半胱氨酸蛋白(RECK)的表达，并下调基质金属蛋白酶(MMP)和基质金属蛋白酶胞外诱导剂(EMMPRIN/CD147)表达，从而逆转上皮间质转化，最终抑制肺癌A549和H1299细胞侵袭和迁移[18]。青藤碱诱导凋亡的通路可能存在于PI3K/Akt、ERK通路之外[19]。β-谷甾醇在体外以剂量依赖的方式抑制肺癌A549、NCI-H460细胞生长，可将A549细胞周期阻滞于G2/M期，并诱发细胞凋亡[20]。

虽然已有北豆根-白附子配伍所含部分化合物的抗NSCLC机制研究，但仍有较多化合物的机制不甚明确，故本研究利用GO功能分析和KEGG富集分析探讨可能存在的抗肿瘤蛋白功能靶点及作用机制。在KEGG富集分析中，富集到多条肿瘤相关的通路，显示北豆根-白附子配伍的广谱抗肿瘤的特性，提示其可能在表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂耐药、血管生成、免疫逃逸、细胞凋亡和调节肿瘤碳代谢等方面发挥抗NSCLC的作用。也为北豆根-白附子配伍相关化合物抗肿瘤作用的进一步研究打下基础。

本研究运用网络药理学方法初步预测了北豆根-白附子配伍治疗NSCLC潜在有效成分的作用机制，可为相应研究提供理论指导。但由于药效成分多种多样，在早期化合物筛选过程中可能遗漏潜在的有效成分；网络药理学通过分子结构功能的预测，初步筛选可能存在的效应通路，但仍存在预测的不确定性，化合物数据库尚待完善，尚具有新化合物、新靶点和新通路发现的可能。中药成分复杂而多样，相关研究开展难度大，网络药理学结合已有资料进行分析研究，不失为探索中药复杂成分组合药理的有效方法。