市售笋子烧牛肉中优势腐败菌的分离与鉴定

甯雨荞，田 靓，袁先铃，刘永明

（四川轻化工大学生物工程学院，四川自贡643000）

0 引言

中国传统菜肴历史悠久，讲究“色、香、味、形、质、营、器”七大特点[1]，具有丰富的文化内涵，同时在人们的日常生活中扮演着重要角色。在长期的实践和经验积累过程中，传统菜肴的营养性、安全性、健康性都得到了检验与验证[2]。但是，传统菜肴工艺原始、工业化程度低、标准化程度不高。目前，已经实现工业化的主要有红烧肉、大盘鸡、梅菜扣肉、麻婆豆腐、鱼香肉丝、盐水鸭、冷吃兔、红烧狮子头、酸菜鱼、黄焖鸡、干锅肥肠、汤类等，大部分菜肴还未实现工业化。传统菜肴的工业化是我国食品工业化的必由之路，势必成为我国食品工业经济新的增长点。

食品在加工、运输、贮藏、销售等环节中，很容易受微生物所污染[3]，微生物污染是食品腐败变质最根本的原因。在中国传统菜肴工业化过程中，关键的问题之一是如何防腐保鲜，延长产品的货架期。在这方面，国内已开展了很多相关的研究，如李慧等人[4]研究了土豆烧牛肉方便菜肴胀袋微生物，发现主要的优势腐败菌是几种芽孢杆菌和表皮葡萄球菌。彭先杰等人[5-6]对导致香辣仔鹅、冷吃兔腐败的微生物进行分离与鉴定，发现导致这些产品腐败的是各种葡萄球菌和芽孢杆菌。刘彩云等人[7]对市售卤牛肉腐败的微生物进行了分离与鉴定，发现导致其腐败的优势菌为魏斯氏菌和佐氏库特氏菌。邓灵等人[8]对导致即食小龙虾腐败的微生物进行了检测，发现蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌是导致其腐败的主要微生物。胡秀虹等人[9]对导致凯里腌韭菜根的优势腐败菌生长特性进行了研究，发现导致其腐败的主要是芽孢杆菌。李德红等人[10]发现副黄假单胞菌、特基拉芽孢杆菌、肉芽肿克雷伯氏菌和香坊肠杆菌导致了酱卤鸭食管冷藏期间的腐败。图尔荪阿依·图尔贡等人[11]研究了香辣蟹中特征性腐败菌和香料的抑制作用。于晓慧等人[12]分离鉴定了常温保藏即食小龙虾的优势腐败菌为柠檬酸杆菌。贾凤娟等人[13]毛木耳红油即食食品的杀菌防腐保鲜技术。Niu C等人[14]研究了香辣酱中致气性腐坏菌。这些研究都为促进传统菜肴工业化奠定了基础。

针对特定食品特定腐败菌防腐技术的开发，其前提是特定腐败菌的识别。目前，虽然有近些年发展起来的基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱法（Matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）的微生物分离与鉴定方法[15-17]，但是传统的微生物分离、生化鉴定和16S rRNA序列鉴定方法[18-23]依然是经典的微生物鉴定方法。以传统菜肴笋子烧牛肉为研究对象，对导致腐败的优势腐败菌采用反复划线培养分离纯种，然后通过生化鉴定和分子生物学鉴定结合的方法对这些腐败菌进行鉴定，为传统菜肴笋子烧牛肉的特异性防腐技术的开发及其工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

笋子烧牛肉制作工艺：牛肉切块→洗净→燎煮→加料炒制→焖煮→装袋→灭菌。

牛肉、水发竹笋、生姜、大葱、食盐、鸡精、白砂糖、香桂、花椒，购自宜宾市临港蓉戎连锁超市。

氢氧化钠（分析纯）、30%过氧化氢、氯化钠（分析纯），成都金山化学试剂有限公司提供；番红花红T、液体石蜡、碘化钾、乳糖、蔗糖，均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂提供；磷酸二氢钠（分析纯），天津市津东天正精细化学试剂厂提供；无水磷酸氢二钾（分析纯），广东光华科技股份有限公司提供；二水氯化钙（分析纯），天津市致远化学试剂有限公司提供；结晶紫（分析纯）、碘（分析纯）、95%乙醇、可溶性淀粉（分析纯）、硫酸铵（分析纯）、七水硫酸镁（分析纯）、甘露醇（分析纯）、无水葡萄糖（分析纯）、明胶（分析纯）、D果糖（分析纯），成都市科隆化学品有限公司提供；牛肉膏、胰蛋白胨、西蒙氏枸橼酸盐、琼脂粉，北京奥博星生物技术有限公司提供。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-IFD型洁净工作台，苏州市万隆化学试剂有限公司产品；SK210型生物显微镜，麦克奥迪实业集团有限公司产品；FCD215SEA型海尔冰柜，青岛海尔特种电冰柜有限公司产品；LRH250C型生化培养箱，韶关市泰宏医疗器械有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 样品的采集与预处理

（1）样品的采集。笋子烧牛肉选自四川省宜宾市翠屏区，分装于灭菌一次性餐盒中，带回实验室存放于常温待其腐败。

（2）样品的预处理。将腐败的笋子烧牛肉置于灭菌的研钵中，研碎后称量5 g溶于45 mL无菌生理盐水中，然后梯度稀释成10-1～10-7的菌悬液备用。

1.3.2 菌株分离与腐败特性试验

（1）微生物的分离。用移液器吸取100μL稀释后的菌悬液加到牛肉膏蛋白胨琼脂平板上，用均布器涂布均匀，于37℃下培养24 h；每个梯度做2个平板并做空白对照组；挑选每个梯度培养基中的典型单菌落，在牛肉膏蛋白胨培养基平板上划线培养，直至得到纯菌落。

（2）优势腐败菌的筛选。将分离得到的菌株加入自制的灭菌笋子烧牛肉中，确定菌株的致腐能力。通过检测接种了纯种菌株的菜肴中氨基酸态氮的质量分数，将致腐能力较强的株菌视为优势腐败菌。

（3）氨基酸态氮的质量分数的测定。参照GB 5009.235—2016《食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》[24]。

1.3.3 优势腐败菌的生理生化鉴定

参考《常见细菌系统鉴定手册》[25]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[26]，对优势腐败菌分别进行革兰氏染色与过氧化氢酶试验、培养基穿刺试验、淀粉水解试验、明胶水解试验、碳源利用试验、VP测定试验、柠檬酸盐试验、MR试验和产葡聚糖试验。

1.3.4 优势腐败菌的分子生物学鉴定

在37℃，200 r/min摇床中培养分离得到的纯种菌株过夜，取1.5 mL纯种菌株悬浮液装入的离心管中，送至上海元莘生物医药科技有限公司检验测序，从菌悬液中提取基因组DNA时采用的方法为硅基质吸附柱法。提取的DNA被选作模板用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）及1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增。PCR 50μL扩增体系为2×Taq Master Mix 25μL，上游引物与下游引物各1μL，模板DNA 1μL并用ddH2O加到50μL；95℃预变性5 min，循环1次；95℃变性15 sec，50℃退火20 sec循环40次；72℃下延伸40 sec。PCR扩增完成后进行凝胶电泳，随之进行测序鉴定。

1.4 数据处理

将DNA测序获得16S rDNA序列与NCBI数据库中的序列进行BLAST比对分析，之后选取近似菌种序列采用MAGE 5软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 腐败菌株的分离筛选

2.1.1 腐败菌株的菌落特征

经过稀释梯度涂布平板和多次平板划线培养，得到4株纯种菌株，分别命名为1，2，3，4号菌。

营养琼脂培养基上菌落形态见表1。

2.1.2 腐败菌腐败特性

熟肉制品腐败时蛋白质经水解或酶解可由大分子变成小的蛋白质成分，如水解后的产物经胨、肽等最后成为氨基酸，氨基酸是构成蛋白质最基本的物质，由此可将氨基酸态氮作为肉类腐败程度检验指标之一。

表1 营养琼脂培养基上菌落形态

4种菌株使笋子烧牛肉腐败后样品中氨基酸态氮质量分数见图1。

图1 4种菌株使笋子烧牛肉腐败后样品中氨基酸态氮质量分数

由图1可知，1号菌的氨基酸态氮质量分数为0.027%，2号菌的氨基酸态氮质量分数为0.064%，3号菌的氨基酸态质量分数为0.085%，4号菌的氨基酸态氮质量分数为0.072%。1号菌的氨基酸态氮质量分数最小，而其他3种菌株的含量相差不大。说明2，3，4号菌的致腐能力较1号强。

2.2 优势腐败菌的生理生化鉴定结果

采用革兰氏染色法，革兰氏染色是鉴别细菌的一种方法，根据细菌细胞壁上主要成分的差异，将染色后的细菌分成两大类，即革兰氏阳性菌（紫色）与革兰氏阴性菌（红色）[27]。在分离纯化试验中，于腐败的笋子烧牛肉中分离纯化出4株菌，将这4个菌株进行革兰氏染色，用100油镜观察。

菌体革兰氏染色结果见图2。

图2 菌体革兰氏染色结果

由图2可知，4种菌均为革兰氏阳性菌。1号菌为球菌，个体较小。2，3，4号菌均呈杆状，其中2号菌为短杆菌，单节，两端圆滑；3号菌为长杆菌，单节或两个相连接，菌体较细；4号菌为长杆菌，菌体弯曲。

通过过氧化氢酶试验、培养基穿刺试验、明胶水解试验、淀粉水解试验、柠檬酸盐试验、碳源利用试验、MR试验、VP试验、产葡聚糖试验，对得到的已分离纯化的菌株进行生化鉴定。

菌株生化鉴定结果见表2。

表2 菌株生化鉴定结果

依据《伯杰氏细菌鉴定手册》[25]与《常见细菌系统鉴定手册》[26]对上述试验结果进行对比，初步对纯化得到的菌株进行鉴定。2，3，4号菌均为过氧化氢试验阳性、明胶水解试验阳性、淀粉水解试验阳性、MR与VP试验阳性，在碳源利用上均可利用葡萄糖、果糖、甘露醇和蔗糖，初步判断2，3，4号菌为芽孢杆菌属细菌；1号菌过氧化氢试验阳性、培养基穿刺试验阳性、明胶水解试验阳性、MR与VP试验阳性，在碳源利用上只能利用葡萄糖、乳糖和蔗糖，初步判断为葡萄球菌属细菌。

2.3 优势腐败菌的分子学鉴定结果

提取4号菌的总DNA，用相应的引物扩增其16S rDNA序列。

纯种菌株16S rDNA凝胶电泳图见图3。

由图3可知，4个样品的条带都在1 000～2 000 bp。

将4株菌的16S rRNA与NCBI数据库中的进行比对，并在此基础上构建系统发育树。

1号菌16S rRNA系统发育树见图4，2号菌16S rRNA系统发育树见图5，3号菌16S rRNA系统发育树见图6，4号菌16S rRNA系统发育树见图7。

图3 纯种菌株16S rDNA凝胶电泳图

图4 1号菌16S rRNA系统发育树

图5 2号菌16S rRNA系统发育树

图6 3号菌16S rRNA系统发育树

图7 4号菌16S rRNA系统发育树

由图4可知，1号菌与金黄色葡萄球菌菌株ATCC 12600（Staphylococcus aureus strain ATCC 12600）同源性最高，其与金黄色葡萄球菌菌株ATCC 12600（Staphylococcus aureus strain ATCC 12600）16S rRNA基因中的部分序列相似的可靠度为94，故判断其为金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性细菌[28]，广泛存在于空气、尘土和动物的排泄物中[29]，因此很容易污染食物。腐败的笋子烧牛肉中分离得到了金黄色葡萄球菌，说明样品在加工、运输等过程中被该菌所污染，而且在适宜条件下成为致腐败的优势菌。

由图5可知，2号菌的序列与暹罗芽孢杆菌KCTC 13613菌株PD-A10（Bacillus siamensis KCTC 13613 strain PD-A10）同源性最高，可判断2号菌为暹罗芽孢杆菌；由图6可知，3号菌的测序结果显示其与苏云金芽孢杆菌菌株IAM 12077（Baillus thuringiensis strain IAM 12077）16S rRNA基因中的部分序列相似的可靠度达到98，所以判断3号菌为苏云金芽孢杆菌；由图7可知，4号菌的测序结果显示其与枯草芽孢杆菌菌株168（Bacillus subtilis subsp.subtilis strain 168）16S rRNA基因中的部分序列相似的可靠度达到90，所以判断4号菌为枯草芽孢杆菌。由此可见，在保证笋子烧牛肉不被致病菌污染的情况，导致笋子烧牛肉腐败的细菌主要是革兰氏阳性的芽孢杆菌。笋子烧牛肉在制作过程中，主要是焖煮等高温处理，一般不耐高温的微生物都能够被杀死，而具有芽孢的细菌则不能够在这种条件下杀死。因此，导致笋子烧牛肉腐败的优势菌大多为芽孢杆菌，这跟其他传统菜肴中分离鉴定出的优势腐败菌相一致[4-11]。

3 结论

笋子烧牛肉是一种烧菜类传统菜肴，深受广大消费者喜爱。早在2010年，何江红等人[30]就研究了笋子烧牛肉的标准化控制，然而其工业化还未完全实现，在生产实际中产品很容易腐败。研究主要分离出了笋子烧牛肉中的腐败菌，通过菌落形态、革兰氏染色、部分生化鉴定对分离出的菌株作了初步的鉴定，然后对纯化菌株进行16S rDNA进行测序，并将其序列与NCBI数据库中的序列进行比对，构建了系统进化树，最终确定了导致笋子烧牛肉腐败的菌株的种属。笋子烧牛肉中的优势腐败菌主要为金黄色葡萄球菌、暹罗芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。其中，枯草芽孢杆菌对笋子烧牛肉的致腐能力最强。枯草芽孢杆菌是常见食品腐败菌，在肉制品中生长快速，会引起笋子烧牛肉的快速腐败变质，使营养物质大量损失。在笋子烧牛肉想要达到工业化生产，可以在不影响食品风味的条件下，从包装条件及配方改造等方面抑制优势腐败菌的生长，从而达到延长产品保质期的目的。