疫情背景下日用豆腐的防腐保鲜技术的探讨

何丽华,孙永祥,戚亚江

(1.杭州市萧山区疾病预防控制中心，杭州 311201； 2.杭州华源豆制品有限公司，杭州 311201)

1 引言

自2020年伊始，新冠肺炎疫情在全球蔓延已成为国际关注的突发公共卫生事件，截止2021年2月17日已造成全球242.7万人死亡，严重威胁人类生命与健康，且疫情仍在延续，新冠肺炎疫情对社会及各行业带来严重影响，如原材料、劳动力等生产要素流通受阻，物流、生产、销售等正常经营活动受到严重干扰，居民消费阻滞，引发全球经济秩序严重破坏。因人类对新冠肺炎病毒缺乏足够认知以及正确的防护，导致疫情传播范围广，时间长，给疫情国家人民生活工作带来巨大影响。疫情的大规模爆发，似乎新冠肺炎病毒无处不在，以致国内外多地冷链食品也出现新冠肺炎病毒检测阳性。如2020年11月-12月，从青岛黄岛海关入关的进口冷冻去骨牛肉臀腰肉心外包装样品有3份检测结果呈阳性；济南市疾控中心在盖世物流园区冷库贮存的进口冷冻食品及包装标本中检测出新冠病毒核酸阳性；等等。被污染的食品像一个导火索，在一个没有疫情的或已经控制本地疫情传播的地方，人因接触被污染的食品而感染，产生新的“零号病例”，从而触发新的疫情。大量科学数据表明，食品不会感染新冠病毒，但有可能被污染，一是受到含有病毒的水、包装材料的污染，二是受到携带病毒的食品加工者污染。食品源继发的疫情为疫情防控带来新的难题，防止食品被污染是切断疫情传播的重要途径之一。因此，疫情背景下对食品的防腐杀菌及卫生防护提出新的挑战。

豆腐是全民通用的日常食品之一，新鲜豆腐的运输储存如同冷冻的牛肉、海产品一样，也遵照冷链运输管理，由于豆腐中蛋白质、脂肪、糖类等含量丰富，且水分含量高，病毒、细菌等微生物在此条件下很容易繁殖而被污染，豆腐被污染途径多种多样。在豆腐制作过程中，大豆原料、加工辅料、生产用具、储存包装等多个环节都有可能被污染，虽然尚未发现豆制品样品出现新冠病毒检测阳性，但是，传统的豆腐防腐杀菌方法可能不一定满足疫情环境下的卫生防护需求，且食用豆腐的人群量大、面广，因此疫情背景下探讨豆腐的防腐杀菌及卫生防护对疫情防控具有重大的现实意义。

豆制品富含有人体必须的氨基酸、低聚糖、不饱和脂肪酸、膳食纤维、卵磷脂、脑磷脂、钙、磷、铁等无机盐和各种维生素等营养丰富易消化[1]。我国大豆制品的生产历史悠久，但生产工艺水平不高，产品保鲜期短。随着人们饮食观念的改变，以植物性食物为膳食模式的重新建立，大豆制品尤其豆腐越来越受到人们的青睐，因此，对传统大豆制品豆腐的生产技术的改造，提高豆制品防腐保鲜及卫生防护，防止食品源疫情传播，势在必行[2]。

2 材料与方法

2.1 材料

(1)豆腐加工：市售当日生产的盒装豆腐，杭州华源豆制品有限公司生产；加工工艺流程为:豆腐→保鲜液浸泡→包装→杀菌→冷却→成品。

(2)抽样：从杭州华源豆制品有限公司生产线上无菌操作随机取下4盒共2000克作为样品。保鲜液浸泡：用研究选定的保鲜液浸泡30 min,保证保鲜液能充分进入豆腐中[1]。

(3)试剂：① 尼泊金酯类防腐剂(即对羟基苯甲酸酯类，包括尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯):上海五联化工厂；② 山梨酸钾:国药集团化学试剂有限公司；③ API20E肠杆菌科和非肠道革兰氏阴性菌鉴定条:法国梅里埃公司;④ API staph葡萄球菌和微球菌鉴定条:法国梅里埃公司;⑤ BAC芽孢杆菌鉴定卡:法国梅里埃公司;⑥ 柠檬酸盐、糖类等微量生化鉴定管:杭州天和微生物试剂公司；⑦ 氧化酶试纸:杭州微生物试剂有限公司;⑧ 10%过氧化氢:上海远大过氧化物有限公司。

2.2 仪器和设备：

① GNP9160隔水式电热恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；② SSW型微电脑电热恒温水浴箱：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；③ Bagmixer样品均质仪：法国INTERSCIENCE公司；④Labpro样品稀释仪：美国Spiral Biotech公司；⑤ VITK32全自动微生物分析系统：法国梅里埃公司；⑥ YXQ-LS50L立式压力蒸汽灭菌器：上海博迅医疗生物仪器股份有限公司。

2.3 方法

2.3.1 杀毒杀菌试验:

新冠肺炎病毒、食品细菌等微生物在高温下大多数能灭活，豆腐样品2盒1000克采用高温水浴(温度82℃,时间30 min)杀毒杀菌，然后冷却至40～50℃,缓解豆腐在高温和高湿度下过度变性析水。

2.3.2 抑菌试验

防腐保鲜剂的抑菌试验设5种浓度，即在5组(每组3只)灭菌平皿中分别加入1.6%浓度抑菌剂0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml,然后依次加入生理盐水0.8、0.6、0.4、0.2、0 ml,每皿各加入菌液1 ml,混匀后各加入45℃营养琼脂14ml轻轻混匀，对应每一平皿抑菌剂浓度分别为0.2/1000、0.4/1000、0.6/1000、0.8/1000、1.0/1000。待平皿内琼脂凝固后置36℃培养48 h，观察菌落生长情况并计数菌落(N),计算最低抑菌浓度抑菌率。计算公式：(10000-N)/10000*100%。

2.3.2 腐败菌分离、鉴定

将杀毒后的盒装豆腐样品，在37℃恒温培养箱中培养，直至豆腐腐败，对主要的腐败菌进行分离，纯化，操作如下：在无菌工作台上，将豆腐盒表面用75%的酒精消毒后从豆腐的不同表面取豆腐25g,加入等量的无菌生理盐水，在研钵中研磨成均匀的悬浊液。以10-1，10-2,10-3,10-4的稀释液中分别取1.0 ml菌悬液放在培养皿中，倒入营养琼脂培养基，混合均匀。平板于37℃恒温箱中培养，在24、48、72 h后观察菌落形态并计数(以下同)。选择培养皿中出现最多的菌落，然后从10-3或10-4稀释度的培养皿中用接种环挑出少许，在营养琼脂平板上划线分离，于37℃培养48 h，取出后观察菌落形态，反复用平板划线法分离直至成为单一菌。将分离、纯化后的菌株接种到营养肉汤液体培养基中，在4～6℃的冰箱中保存。在鉴定前接种到斜面培养基上，于37℃培养48h。鉴定的依据和条件如下：细菌的分类、鉴定遵照伯杰氏系统的细菌学手册。

2.3.4 新冠肺炎病毒(2019-nCoV)核酸检测： ①采集标本。杀毒杀菌后的豆腐样品，采用咽拭子法在外包装盒子前、中、后三个部位擦拭采集标本，同时切取豆腐上、中、下三个部位黄豆大小的豆腐块为标本，采集后样本放入有编号的无菌试管密闭。②样本预处理灭活病毒。用75%的酒精消毒，再进行温度为56°水浴30分钟，使病毒灭活，再常温静置20分钟，。③样本裂解。取560 μl AVL裂解液到1.5 ml无菌EP管中，加入5.6 μl配制好的CarrierRNA，再加入已经灭活的140 μl样本(咽拭子或豆腐块)，混匀振荡15秒，室温静置10分钟，充分裂解样本中核酸。将EP管瞬时离心后加入560 μl无水乙醇，充分混匀15秒，再次瞬时离心后备用。吸取630 μl裂解产物，加入至离心柱中，8000rpm离心1分钟，转移离心柱至新收集管，将剩余的630μl裂解产物加到离心柱中，重复上述离心操作。④ 提取核酸。64通道的自动提取样本，加入到反应板，通过提取仪进行核酸提取。⑤试剂盒检测。采用上海之江生物科技股份有限公司生产的新型冠状病毒(2019-nCoV)核酸检测试剂盒(荧光PCR法)进行自动检测，(仪器注册号20203400057)

2.3.5 保鲜效果评价方法：样品2盒1000克经0.3g/kg浓度尼泊金丁酯浸泡30 min结合82℃ 30 min的巴氏杀毒杀菌综合防腐保鲜处理后，在37℃下保存，每天观察，观察7天，保鲜评价内容包括感官评价[3]、微生物评价[4]和质构分析[5]。

3 结果

3.1 杀毒杀菌

样品经高温水浴(温度82℃,时间30 min)杀毒杀菌后，外包装及豆腐样本新冠肺炎病毒(2019-nCoV)核酸检测均呈阴性(见表1)。

表1 豆腐杀毒后新冠肺炎病毒检测结果

3.2 豆腐的防腐抑菌

豆腐杀毒杀菌后是否能保鲜储存关键在于其腐败菌的生长活性，本研究选用尼泊金酯类和山梨酸两种防腐剂对比观察其抑菌效果，见表2 、表3。

表2 尼泊金酯类的抑菌试验比较

表3 山梨酸的抑菌试验

根据以上抑菌试验，我们可发现各防腐剂对某些细菌有效，某些细菌无效。这和国内报道山梨酸用于豆制品保鲜效果不尽一致。由于豆制品污染的腐败菌不同导致不同保鲜剂的不同效果，山梨酸[6-7]均对霉菌、需氧菌效果较好，但对厌氧性芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌等细菌不敏感。尼泊金酯[6]的防腐效果克服了国内常见防腐剂山梨酸的作用弱且对兼气性芽孢性芽孢形成菌和嗜酸乳杆菌几乎无效以及有PH值影响较大的缺点，从以上豆腐的腐败菌和各防腐剂的抑菌试验结果可以认为尼泊金酯类特别是尼泊金丁酯是较理想的豆腐防腐保鲜剂。

3.3 豆腐中腐败菌的分离鉴定

抑菌试验后进行菌落培养，对培养的菌落镜检，筛选出菌落形态和镜检形态不同的4株腐败菌df1、df2、df3、df4(见表4)。

表4 豆腐腐败菌菌落形态学特征

根据《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版)[8]、《常见细菌系统鉴定手册》[4]对4株腐败菌进行分类鉴定。4个腐败菌株的生理生化特征见表5-表7。

表5 菌株df1的生理生化特征

续表5

表6 菌株df2、df4的生理生化特征

续表6

表7 菌株df3的生理生化特征

续表7

由表4、表5可知，df1菌株为产气肠杆菌，据表4、表6判断df2菌株为松鼠葡萄球菌， df4菌株为木糖葡萄球菌，由据表4、表7判断df3菌株为梭形芽孢杆菌。

3.4 保鲜效果评价

依据豆腐腐败菌的菌种，有理由选择尼泊金丁酯高敏感性防腐剂。豆腐样本经杀毒杀菌及尼泊金丁酯防腐保鲜剂处理，在37℃的恒温箱下保存，每天观察，进行微生物评价、感官评价和质构分析方法。

3.4.1 尼泊金丁酯对豆腐中微生物的影响。采用MPN法 (most probable number,最大可能数) 来估算细菌浓度，观察不同浓度尼泊金丁酯对豆腐微生物学指标的影响，结果见表8、表9。

表8 0.2g/kg浓度尼泊金丁酯对豆腐微生物的影响

表9 0.3g/kg浓度尼泊金丁酯对豆腐微生物的影响

表8可知，经过0.2 g/kg浓度尼泊金丁酯保鲜液浸泡处理，密封包装杀菌的豆腐在37℃保存第3天，就有大量的微生物繁殖，这和前面的抑菌研究相一致，说明在0.2 g/kg浓度下还能使部分细菌繁殖。表9的结果表明，0.3 g/kg的保鲜剂溶液浸泡处理，密封包装杀菌的豆腐中，37℃保存7天，细菌总数和大肠菌群近似值均达到出厂卫生标准[9]。0.3 g/kg浓度尼泊金丁酯防腐保鲜效果更理想。

3.4.2 对豆腐质构的影响

豆腐经杀菌杀毒以及防腐保鲜技术处理后，必须要保证食品物理结构不能遭受破坏，包括其硬度、弹性、内聚性、咀嚼型、破裂性等，经食品TPA质构分析(Texture Profile Analysis，TPA)，结果见表10。

表10 豆腐TPA质构分析结果

表10可知，防腐保鲜杀毒处理后的豆腐硬度、胶粘性、咀嚼性、弹性、内聚性、回弹性和破裂性无显著变化。

4 讨论

我国豆腐的加工及防腐保鲜技术长期以来比较稳定成熟，不论南豆腐、北豆腐均能满足国家卫生标准要求。由于新冠肺炎疫情突然出现，且食品源疫情偶有发生，迫使我们加强食品卫生监督与防范。传统豆腐制作过程中再增加杀毒杀菌，必然涉及防腐剂的选择与成本核算。为了保证豆腐的食品营养价值及感官性能不变的要求，本文尝试新的豆腐防腐保鲜技术，为防止食品源疫情选择新的合理的豆腐防腐保鲜剂提供科学依据。

4.1 豆腐腐败菌的类型及其来源

豆腐制作工艺流程基本相同：大豆原料→洗豆→泡豆→磨浆→滤浆→煮浆(出口温度120℃)→冷却→豆腐→保鲜液浸泡→包装→杀菌(82℃杀菌时间30min)―?冷却→成品。豆腐是不经发酵过程制成的食品，其中水分含量高，是最容易腐败的非发酵豆制品[10]。而盒装豆腐的生产，是采用机械化、自动化的生产技术，为了减少二次污染，最大限度地排除干扰因素，本研究以盒装豆腐为研究对象，探讨盒装豆制品腐败微生物及其保鲜技术。

豆腐营养丰富，水份含量高，非常有利于微生物的繁殖，即使盒装豆腐在夏天的保质期也不过1天，冬天(0-4℃)不超过3天，极易腐败变质[11]。对豆腐中主要腐败菌的鉴定以及保鲜技术研究，国内外的文献报道并不多，且结论也不一致。邓勇、滕刚[11]等人对萄糖酸一δ一内酯(GDL)豆腐中腐败菌进行了分离鉴定，认为GDL豆腐中的主要腐败菌为耐热性的枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌，其数量分别占总菌数的75%和15%。刘兴玲等[12]认为豆制品的腐败主要因霉菌、酵母、乳酸菌还有厌氧杆菌引起的。Tuitemnwong K和Fung DYC[13]研究了在7℃贮藏1天和30天后的7种品牌的传统豆腐及渗出汁液中的腐败菌，认为豆腐的腐败根据豆腐物理性质和初始的微生物而改变。所分离的微生物中，最普遍的革兰氏阳性菌为链球菌属、片球菌属、乳杆菌，最普遍的革兰氏阴性菌为绿脓假单胞菌、恶臭假单胞菌、产气杆菌、阴沟肠杆菌。Hegeman GD等[14]研究了石膏豆腐(真空包装)在2-3℃贮存的腐败微生物。贮藏30天后，豆腐中的主要腐败菌为乳酸菌、肠道菌和假单胞菌属。Dotson 等[15]认为豆腐的腐败是由乳酸菌引起的，并提出了一种测量豆腐腐败的方法。对于防腐剂的选择应用也不相同。林桂芸、曾心礼等人[16]认为豆制品主要腐败是因真菌和酵母引起的，所以采用山梨酸钾和大蒜对其进行防腐抑菌。孔保华和迟玉生等[17]认为豆制品主要为乳酸菌，所以选择乳酸链球菌素来防腐保鲜。肖凯、赖本丽等人[18]采用双乙酸钠、山梨酸钾、大蒜汁进行保鲜。由于引起豆制品腐败的主要微生物研究结论不尽相同，国内外对豆制品的保鲜技术的报道也有很大区别[19-20]，使之对豆制品防腐保鲜技术的方法也没有一致的结论，而腐败菌的确定是研究保鲜技术的基础。因此，本研究只能依据当地豆腐的腐败菌培养鉴定来选择敏感的防腐保鲜技术。

植物蛋白类产品中微生物菌相主要来源于土壤和空气中的浮游芽孢杆菌、水源细菌和人畜粪便细菌，如芽孢杆菌和革兰氏阴性菌。豆制品成品中微生物的来源主要有原料、生产环境、生产过程、生产操作人员和运输过程等[21]。李博等[10]认为盒装豆腐中的腐败菌种为坚强芽孢杆菌和屎肠球菌，其最初来源是大豆原料。Hegeman GD 等[14]研究真空包装的豆腐2℃-3℃贮存时，主要的腐败微生物为乳酸菌肠道菌和假单胞菌，其中腐败微生物可能是由生产过程中带入的。Tuitemwong,K and Fung,D.Y.C等[13]研究了在7℃贮存1天和3天后豆腐中的腐败菌，认为豆腐腐败依据其物理性质和初识的微生物而不同。最普遍的G+微生物为链球菌属，乳杆菌属，片球菌属；最普遍的G-微生物为绿脓假单胞菌，恶臭假单胞菌等。虽然豆腐腐败菌的来源各种报道有些出入，但肯定一点微生物如假单胞菌、大肠杆菌、粪链球菌、乳酸菌及成团肠杆菌等绝大部分微生物在煮浆(120℃)及热凝固(118℃)过程中被杀死[22],所以邓勇等人对盒装豆腐腐败菌鉴定为枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌。本研究根据豆腐腐败菌分型鉴定，表明浙江本地盒装豆腐中的腐败菌主要为梭形芽孢杆菌、产气杆菌、松鼠葡萄球菌和木糖葡萄球菌。依据腐败菌的生长属性可以推测豆腐中的梭形芽孢杆菌属主要来源于大豆原料，产气杆菌、松鼠葡萄球菌和木糖葡萄球菌主要来源于生产过程由设备带入以及制作后期的豆腐相接触二次污染所致。

4.2 豆腐的防腐保鲜剂选择

根据豆腐的腐败菌分析，豆腐中最普遍存在微生物绝大部分在煮浆及热凝固中被杀死，不易杀死的芽孢杆菌和由设备带入的或制作后期豆腐接触人员污染的产气杆菌、松鼠葡萄球菌以及新冠病毒等必需采用其他综合防腐保鲜技术。为了使保鲜豆腐在产品保质期内不发生变劣及不被污染，保持新鲜豆腐品质，保鲜剂的选择必须是广谱及对芽孢杆菌敏感。苯甲酸钠和山梨酸是目前国内食品业中最普遍的广谱化学防腐剂，但是0.lg/kg的苯甲酸钠加入食品后便可尝出异味，而且当PH>4时，抑菌效果会明显下降[23],因此苯甲酸钠不适合用于豆制品。山梨酸是一种高效低毒的化学防腐剂，其防腐效果在PH值在5-6范围较理想，且无异味[24]。豆腐的保存过程中，由于产酸微生物的繁殖会导致PH值下降，会影响其防腐保鲜剂抑菌效应，但是国内也有报道其对豆腐的防腐的效果较好[16,18]。所以可将山梨酸作为备选防腐剂。目前国际上常用尼泊金酯类作为防腐剂，但是国内很少用。尼泊金酯类防腐剂主要有4种：尼泊金甲酯、尼泊金乙酯、尼泊金丙酯、尼泊金丁酯，从理论上看[6]，尼泊金酯类防腐剂具有使用量小，毒性小等优点。因此，本次研究主要采用后期保鲜方法对己制成的新鲜豆腐进行保鲜处理，基于豆腐主要腐败菌PH值以及国内外使用防腐剂的研究成果，拟选用山梨酸、以及尼泊金甲、乙、丙、丁酯进行防腐保鲜抑菌试验，期望能寻找到一种科学合理的豆制品防腐保鲜剂。

本次研究经山梨酸、尼泊金甲、乙、丙、丁酯的防腐保鲜对比试验，结果表明，山梨酸均对霉菌、需氧菌效果较好，但对厌氧性芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌等细菌不敏感。尼泊金酯的防腐效果克服了山梨酸的抑菌作用弱且对兼气性芽孢性芽孢形成菌和嗜酸乳杆菌几乎无效以及有PH值影响较大的缺点，综合分析，豆腐高温杀毒后经0.3g/kg的尼泊金丁酯防腐保鲜剂溶液浸泡处理，结合密封包装杀菌，37℃保存7天，细菌总数和大肠菌群近似值均达到出厂卫生标准[9]，TPA质构分析效果良好。因此，选择0.3g/kg浓度尼泊金丁酯作为防腐保鲜剂较为理想。

5 结论

本研究认为盒装豆腐增加高温杀毒杀菌可以满足疫情检验卫生需求。豆腐腐败微生物很可能是耐热性的芽孢杆菌和由设备带入以及制作后期所接触污染所致。尼泊金丁酯能有较好的抑菌作用，是豆制品较为理想的保鲜剂。选用0.3 g/kg浓度的尼泊金丁酯浸泡豆腐30 min,并结合82℃,30 min的巴氏杀菌处理，能在37℃环境下保存7天，并无质构明显变化。