超声波协同复合酶提取花椒麻味物质工艺的优化

周敏，蒲升慧，刘福权，赵志峰，吕远平

(四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610065)

花椒(Zanthoxylumbungeanum)是芸香科花椒属植物，全世界约有250个花椒品种[1]。花椒在我国具有广泛的应用和悠久的栽培历史，它是中国烹饪文化和四川美食的传统调味品之一，具有独特的麻味[2-3]。据研究报道，花椒中的化学成分包括生物碱类、酰胺类、挥发油、木脂素、香豆素、黄酮类及多酚类等[4-6]，花椒的刺痛感和麻木感是由酰胺类物质即麻味物质所引起的，它是评价花椒品质的重要指标[7]。目前，溶剂提取法广泛应用于麻味物质的提取，但存在着提取时间长、提取率低或费用高等缺点[8-9]。研究者报道了超声波技术[10]和酶法[11]可用于花椒麻味物质的提取工艺，超声波利用其空化作用和机械效应对原料进行破碎，促进胞内的麻味物质扩散、溶出；酶能够水解纤维素，促进麻味物质的溶出，并且多种酶混合使用可能具有协同作用，提取效率优于单一酶处理[12]。超声波协同复合酶法能有效避免常规溶剂提取法的缺陷，但对于超声波协同复合酶提取麻味物质的研究还未见相关报道。

因此，本文在传统溶剂提取法的基础上增加超声波与复合酶处理，采用混料设计与响应面设计优化花椒麻味物质的提取工艺，以达到高效提取花椒麻味物质的目的，实现花椒资源的高效利用。

1 材料、仪器与方法

1.1 材料与仪器

实验原料：干燥的红花椒果皮，收获于2019年9月，由四川五丰黎红食品有限公司提供。将其粉碎过40目筛，并存放于-18 ℃冰箱备用。

主要试剂：纤维素酶(EC 3.2.1.4，50 U/mg)、半纤维素酶(EC 3.2.1.78，20 U/mg)、果胶酶(EC 3.2.1.15，500 U/mg)：均为分析级，购于源叶生物科技有限公司；食用酒精(95%)：购于河南鑫河阳酒精有限公司；戊二醛和磷酸：均为分析试剂，购于成都市科龙化工试剂厂。

主要仪器：SHA-B水浴恒温振荡器 江苏金城国胜实验仪器厂；KQ-300VD三频数控超声波清洗机 昆山禾创超声仪器有限公司；RE-5299旋转蒸发仪 上海道京仪器有限公司；TD25-WS离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；LC-6AD高效液相色谱仪 日本岛津公司；JSM-7500F场发射扫描电子显微镜 日本电子株式会社(JEOL)。

1.2 实验方法

1.2.1 花椒麻味物质的提取工艺

50 g花椒粉经500 mL超纯水蒸馏提取后，过滤料液并收集花椒残渣，称其重量记为M1。取20 g花椒残渣和200 mL超纯水混合并在恒温振荡培养箱中水解3 h，温度控制在(40±1) ℃，pH 4.8±0.2(采用10 mg/mL柠檬酸进行调节)。水解完成后，加入200 mL食用酒精，在(50±1)℃条件下浸提3 h，减压抽滤并收集滤液，经减压蒸干后，收集剩余成分，即麻味粗提物。向麻味粗提物中加入100 mL食用酒精，振荡使其溶解后于4000 r/min条件下离心15 min，收集上清液，再通过减压蒸干收集浸膏状成分，即麻味物质，称其重量记为M2。麻味物质提取率的计算公式如下：

麻味物质提取率(%，W/W)=[(M1×M2)/(20×50)]×100。

(1)

1.2.2 花椒麻味物质提取工艺优化

1.2.2.1 复合酶混料设计

利用Design-Expert 8软件中混料设计(单行格子设计{3,2})筛选纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的最佳配比，以3种酶的占比为自变量，麻味物质提取率为响应值。混料设计实验因素水平见表1。

表1 混料设计实验因素水平表Table 1 The factors and levels of mixture design test

1.2.2.2 响应面实验

通过Plackett-Burman实验[13]筛选出影响麻味物质提取率的显著性因素为：酶添加量、酶处理温度和超声功率。

a.单因素实验

酶添加量：在酶处理温度40 ℃，pH 4.8，酶处理时间3 h，超声功率120 W，超声时间30 min的条件下，考察酶添加量(2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%)对麻味物质提取率的影响。

酶处理温度：在酶添加量3.0%，pH 4.8，酶处理时间3 h，超声功率120 W，超声时间30 min的条件下，考察酶处理温度(40，45，50，55，60 ℃)对麻味物质提取率的影响。

超声功率：在酶添加量3.0%，在酶处理温度50 ℃，pH 4.8，酶处理时间3 h，超声时间30 min的条件下，考察超声功率(120，150，180，210，240，270，300 W)对麻味物质提取率的影响。

b.Box-Behnken中心组合实验优化

在单因素实验结果基础上，根据Design-Expert 8软件中Box-Behnken中心组合实验设计原理，以酶添加量、酶处理温度和超声功率为自变量，麻味物质提取率为响应值，在三因素三水平实验上优化得出工艺最佳参数[14]，因素水平设计见表2。

表2 响应面实验因素水平表Table 2 The factors and levels of response surface analysis design

1.2.3 扫描电镜实验

花椒样品用2.5%戊二醛溶液固定静置12 h，然后利用pH 6.8, 0.1 mol/mL的磷酸缓冲液冲洗3次，每次10 min，最后用不同溶度梯度(40%、60%、80%、90%、100%)的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每次10 min。再将脱水后的样品进行临界点干燥，然后用胶带固定，并进行喷金处理，最后利用扫描电镜进行观察。

2 结果与分析

2.1 复合酶混料设计实验结果

由表3可知，使用果胶酶可以提高麻味物质的提取率，而纤维素酶或半纤维素酶则无此现象，这可能与纤维素、半纤维素和果胶在花椒细胞中的组成有关。此外，纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶在麻味物质提取中可能具有协同作用，与对照组和单一酶处理组相比，按一定比例复配的复合酶可显著提高麻味物质的提取率。纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶三者间配比与麻味物质提取率间关系可用多项式方程进行拟合，表示为Y=10.07X1+9.43X2+10.68X3+0.032X1X2+6.44X1X3-0.27X2X3+81.90X1X2X3。

表3 混料设计实验方案及结果Table 3 The experimental scheme and results of mixture design

由表4可知，该模型特征值中P>0.05，失拟项不显著，且R2值为0.9405，说明此方程拟合有效，可对不同酶配比条件下麻味物质提取率进行分析和预测。

表4 混料设计实验结果统计学分析Table 4 The statistical analysis for the results of mixture design

由图1可知，3种酶的配比对麻味物质提取率有显著影响，等高线越靠近中心其形状越接近于椭圆，此时3种酶的交互作用显著。因此,通过回归方程得出复合酶的最佳配比为纤维素酶36.2%、半纤维素酶26.0%和果胶酶37.8%，此时预测麻味物质提取率为13.94%。

图1 复合酶交互作用对麻味物质提取率影响的等高线图和响应面图Fig.1 The contour plot and response surface plot of the effect of compound enzymes interaction on the extraction rates of numb-taste components

验证实验结果表明，麻味物质提取率为(13.27±0.28)%，与回归模型预测值无显著差异。因此,纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的最佳配比结果真实有效。

2.2 响应面实验结果

2.2.1 单因素实验结果

3个显著性因素对麻味物质提取率影响的单因素实验结果见图2。

图2 酶添加量(a)、酶处理温度(b)和超声功率(c)对麻味物质提取率的影响Fig.2 The effects of enzyme additive amount (a), enzyme treatment temperature (b) and ultrasonic power (c) on the extraction rates of numb-taste components

由图2可知，3个因素的较优参数分别为：酶添加量3.0%，酶处理温度50 ℃，超声功率210 W。

2.2.2 Box-Behnken中心组合实验结果

运用Design-Expert 8软件对实验结果进行分析，得到因变量与自变量之间的二项式拟合方程：Y=15.64+0.28A+0.18B-0.06C-0.29AB+0.17BC- 0.76A2-1.10B2-0.50C2+0.49AB2-0.10B2C。进一步对回归模型进行方差分析，结果见表5。

表5 响应面优化实验结果统计学分析Table 5 The statistical analysis for the results of response surface analysis design

由表5可知，二项式拟合模型具有极显著性(P<0.0001)，模型修正系数R2=0.9942，说明该模型预测值与实验的实际值拟合较好；失拟项P值为0.4237(P>0.05)，失拟项不显著，表明方程模型误差较小[15]。根据回归分析结果，分别固定一个自变量的中间值，绘制因变量随自变量变化的响应曲面图(见图3)。发现酶添加量与酶处理温度的交互作用较显著，而酶添加量与超声功率和酶处理温度与超声功率的交互作用不显著。因此，对回归模型进行优化分析得到麻味物质提取的最佳工艺参数为：酶添加量3.08%、酶处理温度50.3 ℃和超声功率208.5 W，此时麻味物质的提取率为15.67%。

图3 各因素交互作用对麻味物质提取率影响的等高线图和响应面图Fig.3 The contour plots and response surface plots of the effects of interactions of various factors on the extraction rates of numb-taste components注：A为酶添加量与酶处理温度；B为酶处理温度与超声功率；C为酶添加量与超声功率。

2.2.3 验证实验

在上述优化的最佳工艺下进行验证实验，得出麻味物质提取率为(15.14±0.54)%，与回归模型预测值无显著差异。因此该模拟结果真实有效，在此条件下花椒麻味物质提取率从10.24%提升到15.14%。

2.3 扫描电镜结果

2.3.1 不同酶处理后花椒细胞扫描电镜结果

扫描电镜图(见图4)显示了未处理样品和不同酶处理样品的花椒细胞破碎情况。

图4 不同酶处理后花椒细胞电镜扫描图Fig.4 The scanning electron microscopy of Zanthoxylum bungeanum cells treated with different enzymes注：A为对照组；B为纤维素酶组；C为半纤维素酶组；D为果胶酶组；E为复合酶组。

由图4中A可知，未处理的花椒细胞中虽然出现大量皱缩情况，但是细胞结构较为完整，无大量细胞壁破裂现象。而经过纤维素酶(见图4中B)、半纤维素酶(见图4中C)、果胶酶(见图4中D)和复合酶(见图4中E)处理后的花椒细胞均出现大量细胞破裂现象，且细胞表面可见明显破裂碎片。值得注意的是，复合酶处理后，花椒细胞破裂情况最为严重，细胞出现大量孔洞。因此表明与未处理组相比，使用酶处理均能破坏花椒的细胞结构，并且纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的混合使用可能具有协同作用，从而增强对花椒细胞结构的破坏。

2.3.2 不同方法处理后花椒细胞扫描电镜结果

扫描电镜图(见图5)显示了不同方法处理后花椒细胞破裂情况。

图5 不同方法处理后花椒细胞电镜扫描图Fig.5 The scanning electron microscopy of Zanthoxylum bungeanum cells with different treatment methods注：A味精对照组；B为复合酶组；C为超声组；D为复合酶与超声组。

由图5中A可知，未处理的花椒细胞中虽然出现大量皱缩情况，但是细胞结构较为完整，无大量细胞壁破裂现象。复合酶处理后(见图5中B)，花椒细胞结构明显被破坏，细胞壁出现不规则锯齿状边缘，细胞空隙变大。超声波处理后(见图5 中C)，花椒细胞壁破裂，出现大量可见碎片，并且细胞间出现较大的撕裂断痕。此外，经过超声波与复合酶共同处理的花椒细胞(见图5中D)破坏最为严重，不仅细胞壁破裂形成小碎片，而且在细胞间还出现巨大破裂孔洞。因此，与未处理组相比，使用复合酶处理、超声处理和超声波与复合酶共同处理均能破坏花椒细胞结构，并且超声波与复合酶共同处理可能具有协同作用，从而增强对花椒细胞结构的破坏。

3 结论

本文为提高传统提取方式下花椒麻味物质的提取率，采用超声波协同复合酶处理提取花椒中的麻味物质。通过混料设计、单因素实验和Box-Behnken中心组合设计得到最佳的提取工艺条件：酶添加量3.08%，酶处理温度50.3 ℃和超声功率208.5 W。扫描电镜实验解释了麻味物质提取率提高的原因，超声波协同复合酶处理可能存在协同作用，使花椒细胞结构破坏得更加彻底，有利于麻味物质溶出。因此，超声波协同复合酶处理作为改进后的工艺，与传统的提取工艺相比具有显著的优势，有效地提高了花椒风味物质的提取率，可为进一步开发和利用花椒中的麻味物质提供理论依据。